Учреждение Российской академии наук Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН г. Москва

Известно, что этиленимин и его производные алкилируют ДНК и белки (см. обзор [1]). Этиленимин и этиленимиды взаимодействуют с ДНК, индуцируют мутации (у дрозофилы, высших растений, грибов, бактерий, вирусов и других объектов, нарушения хромосомного аппарата (см., например, обзор [2]). Химические соединения, вызывающие мутации и нарушения хромосом, получили название «химические мутагены».
В 50-60-х годах за рубежом и позднее, с медленным возрождением генетики после пагубного периода «лысенкоизма», в СССР были развернуты цитогенетические исследования повреждений хромосом химическими мутагенами (разрыв–слияние–разрыв, элиминация хромосом или их фрагментов, образование микроядер и другие), именуемых перестройками, аберрациями или структурными мутациями, по терминологии разных авторов. Изучался механизм повреждений хромосом и их связь с митотическим (клеточным) циклом. Ана-телофазным методом изучали асинхронные в отношении стадий митотического цикла объекты – клетки меристемы кончика корня проростков растений – лука, бобов, скерды (крепис) и др., первичную культуру эмбриональных клеток животных и человека.
В механизме цитогенетического действия химических веществ и ионизирующей радиации было выявлено различие. Ионизирующая радиация повреждает хромосомы сразу после облучения на всех стадиях митотического цикла – «незадержанное» действие. В клетках, пришедших в митоз из фаз G2 и S, обнаруживаются перестройки хроматидного типа, в клетках, пришедших из досинтетической фазы G1 – перестройки хромосомного типа (двойные мосты, парные фрагменты).
При действии химических мутагенов в делящихся клетках, находившихся во время обработки в стадии митоза и на постсинтетической стадии (G2), перестроек хромосом не наблюдается. В асинхронной культуре перестроек не обнаруживают в течение 3-4 часов (в зависимости от объекта исследования) после обработки – «задержанное» действие. Перестройки обнаруживаются позже – при вступлении в митоз клеток, обработанных в начале или в ходе синтеза ДНК (фаза S). В ана-телофазах наблюдаются «мосты» хроматидного типа – одиночные с фрагментами или без фрагментов, возникшие в результате либо разрывов одной нити ДНК, или при нарушении ее синтеза. Образуются также непарные и парные фрагменты. Большое число хромосом у многих объектов затрудняет идентификацию перестроек хромосом на метафазных пластинках. Поэтому у этих объектов изучают анафазы и телофазы. При этом фрагменты хромосом или разорванные мосты могут и не выявляться. Для анализа экологического заражения окружающей среды ана-телофазный метод достаточен. Примером может служить оценка загрязнения в промышленном районе города Старый Оскол, проведенного Калаевым и соавторами [3] на меристеме проростков березы.
В Москве 60-е-70-е годы обширные работы по цитогенетическому изучению химического и радиационного мутагенеза проводились Н.П. Дубининым, его сотрудниками и учениками (Дубинина Л.Г., Кеслер Г.Н., Лекявичюс Р.К., Макеева Н.П., Митрофанов Ю.А., Немцева Л.С., Сапрыкина Е.Н., Щербаков В.К. и др.). Изучали цитогенетические эффекты ионизирующей радиации, химических соединений – производных этиленимина, лекарственных препаратов. Из этого коллектива вышло большое число статей, сборников, несколько монографий.
Н.П. Дубинин сформулировал представление о механизме действия мутагенов: мутагены вызывают потенциальные изменения в хромосомах на всех стадиях митотического цикла, которые реализуются в ряде клеточных поколений. Он назвал это «цепным процессом» в мутагенезе (см., например, обзор [4]).
Параллельно в лабораториях Н.Н. Соколова и Б.Н. Сидорова (Андреев В.С., Генералова М.В., Гриних Л.И., Дурыманова С.Е., Каграманян Р.Г., Протопопова Е.М., Шевченко В.В. и др.) велись обширные работы на модельном объекте Crepis capillaris по индукции хромосомных нарушений, их локализации в хромосомах, связи с фазами митотического цикла и синтезом ДНК при обработке проростков этиленимином, тиоТЕФ, радиацией и другими мутагенами.
В начале 60-х годов, работая у Н.П. Дубинина, я исследовала цитогенетический эффект алкилирующего соединения фосфемида (phosphemidum, синоним фосфазин) – ди-(этиленимид)-пиримидил-2-амидофосфорной кислоты (рис. 1).

Митотическую активность проростков определяли по двум критериям:
– по критерию числа метафаз по отношению к числу просчитанных ядер в контроле и опытах (после обработки семян) использовали проростки через 2, 4, 6, 8, 10 и 20 часов после проклёва. В каждом проростке просчитывали от 500 до 1000 ядер;
– по критерию числа проростков с метафазами по отношению ко всем просмотренным проросткам и на всех сроках фиксации.
Во всех опытах оценивали стандартное отклонение от средней величины.
Результаты и обсуждение
Естественный уровень митотической активности – контроль оценивался по критерию числа ядер в проростках. Из 18 000 просчитанных ядер в контроле, метафазы составили 2,83±0,12%.
По критерию числа метафаз в просмотренных корешках естественный уровень митотической активности в разные годы урожаев (1966, 1967, 1969гг) колебался в пределах 90-99% (табл. 1). Частота метафаз с перестройками в семенах урожая 1966 года колебалась 0,24-0,44% .
В семенах урожая 1967 года наблюдалась явная тенденция к увеличению частоты перестроек по мере их хранения (см. табл. 1). Митотическая активность в 1967 году около 90%, в среднем по годам и срокам - около 95%. Перестройки хромосомного типа встречались редко. За все годы обнаружено 50 таких перестроек (см. табл. 1). Нужно отметить тенденцию к увеличению их числа при старении семян (урожай 1967 года, 19 месяцев хранения). Средний уровень метафаз с перестройками в разные годы был менее 2%, перестроек хромосомного типа в среднем 0,55%, наибольшее их число в 1967 году (см. табл. 1).

Таблица 1. Естественный уровень перестроек хромосом в 2n-клетках меристемы Crepis capillaris после замачивания семян в воде и проращивания в 0,01%-ном колхицине. Урожаи 1966, 1967, 1969 годов

При подсчете ядер в корешках после воздействии фосфемида в концентрациях от 1 · 10^–2 до 5 · 10^–4 M из 68 500 просчитанных ядер 743 были метафазные – в среднем 1,08±0,06%, т. е. фосфемид подавлял митотическую активность более чем вдвое (см. выше – 2,82% в контроле).

После воздействия фосфемида на семена в среднем по всем концентрациям и срокам фиксации проанализировано 17 513 проростков с метафазами, среди них было 2306 метафаз с перестройками (13,17%). Среди перестроек меньше одного процента составляли перестройки хромосомного типа – 0,113%. Величина, сходна с естественной частотой.

При концентрации фосфемида 2 · 10^-3M митотическая активность в среднем была 51,5% (табл. 2), т. е. вдвое ниже, чем в контроле (см. табл. 1).

Таблица 2. Перестройки хромосом в 2n-клетках проростков Crepis capillaris через 24 и 27 часов от начала обработки семян в растворе фосфемида 2 · 10^{-3 M} (2,24мг препарата, 5мл воды). Фиксации через 3-8 часов. Проращивание в 0,01%-ном колхицине. Урожай 1967 года. Анализ в апреле 1968 года

Примечание. Отдельные метафазы с множественными нарушениями хромосомного аппарата или веретена деления встречались, но не учитывались.

Митотическая активность фосфемида в концентрации 1 · 10^-2M и при обработке такого же количества семян, что и в таблице 2, была ниже в среднем почти вдвое (табл. 3). Большая концентрация фосфемида (2 · 10^-3) вызывала значительное снижение митотической активности (25%), увеличение числа метафаз с перестройками: 22,53% против 14,8% при более слабой концентрации фосфемида и приводила к высокой частоте множественных нарушений метафаз и веретена деления (см. табл. 3, помечено звездочкой).

Таблица 3. Перестройки хромосом в 2n-клетках проростков Crepis capillaris через 24 и 27 часов от начала обработки семян в растворе фосфемида 1 · 10^-2М (22,4мг препарата, 10мл воды). Проращивание в 0,01%-ном колхицине. Урожай 1967 года. Анализ в апреле 1968 года

Примечание.(*) Сильно пораженные метафазы с множественными перестройками.

Средний уровень метафаз с хроматидными перестройками был выше, чем при большем разведении (2 · 10^-3М), в основном за счет большого числа перестроек (59,46%) через сутки после 27-часового проклёва, из которых 16,4% составили митозы с множественными перестройками. В среднем значительно увеличилось число сильно пораженных метафаз – 13,3±2,9%. Перестроек хромосомного типа при данном разведении не обнаружено ни на один срок фиксации.

При хранении необработанных семян и обработке семян в июне и июле 1968 года картины митотической активности и частоты перестроек были различными, несмотря на применение одной и той же концентрации фосфемида 2 · 10^–2 М (рис. 3 и 4). Митотическая активность оказалась выше (см. рис. 3а и 4а), чем в апреле, правда при иных концентрациях фосфемида. При увеличении времени от проклёва до фиксации – через 12 часов после проклёва частота проростков с митозами приближалась к 90% и была ненамного ниже контрольного уровня.

При проклёвах через 24 и 27 часов митотическая активность стабильно возрастала по срокам фиксации. При более позднем проклёве - 36 часов (см. рис. 3а) или 31 час она колебалась на более высоком уровне, чем при ранних сроках проклёва и фиксациях от проклёва. Данные рисунков 3 и 4 статистически значимы.
Частота метафаз с перестройками хромосом стабильно возрастала во фракции 24-часового проклёва при фиксациях от 3 до 12 часов (см. рис. 3б) и от 3 до 9 часов (см. рис. 4б).
При 27-часовом проклёве частота метафаз с перестройками была относительно стабильной – на уровне наибольшей частоты 24-часового проклёва (см. рис. 3б и 4б).
В 36-часовом проклёве частота перестроек возрастала при увеличении времени от проклёва до фиксации (см. рис. 3б), через 12 часов уровень перестроек был почти 23%, в 31-часовом проклёве (см. рис. 4б) при фиксациях через 3 и 4 часа частота перестроек была на высоком уровне – 17-18%.
При всех сроках фиксации наблюдались перестройки хроматидного типа и единичные перестройки хромосомного типа – в среднем меньше 1%, т. е. на уровне контроля.
Из данных рисунков 3 и 4 следует, что в первом проклёве – через 24 часа после начала обработки семян при любых фиксациях и концентрациях частота перестроек возрастает от 3 часов и дальше. Отсюда следует, что в семенах Cr. capillaris зародышевые клетки находятся на разных стадиях митотического цикла. Уровень перестроек при ранних фиксациях был ниже, чем на более поздних сроках, по-видимому, благодаря тому, что мутаген воздействовал на хромосомы наименьший период времени. Но возможно, синтез ДНК в клетках, пришедших в митоз на ранних сроках фиксации, в основном был завершен. Синтезирующих ДНК участков было меньше, чем при более длительном воздействии на хромосомы в более поздние сроки фиксации. По мере перехода к митозу из фазы синтеза ДНК частота перестроек увеличивается. Сохранение высокой частоты перестроек при более поздних проклёвах подтверждает взаимодействие препарата с хромосомой в фазе синтеза ДНК. Отсутствие в метафазах перестроек хромосомного типа (на уровне или даже ниже контроля) при всех сроках проклёва и фиксации говорит о том, что препарат не влияет на хромосомы до начала синтеза ДНК.
Повышение митотической активности проростков по мере фиксации проростков указывает на возможность вымывания препарата из клеток в ходе роста проростков. Увеличение числа перестроек в проклёвах с увеличением сроков фиксации и общий высокий уровень метафаз с перестройками в проростках говорит о том, что фосфемид при поступлении в семена с начала их обработки включается в метаболизм клеток и сохраняется в них длительное время.
Фосфемид подавлял митотическую активность тем сильнее, чем больше была его концентрация (см. табл. 2 и 3, рис 3а, 4а).
Данные табл. 3 говорят о том, что фосфемид взаимодействует с белками веретена деления, поскольку при большей концентрации препарата значительно увеличивается число сильно поврежденных митозов, часто такие метафазы образуют нечто вроде звезды в центре клетки. Подобные картины мы наблюдали и в культуре фибробластов. Кроме этих нарушений, в некоторых клетках мы наблюдали, как все хромосомы в одной клетке как бы разломаны на фрагменты.

Выводы
1.    Обрабатывали семена Crepis capillaris алкилирующим агентом фосфемидом. Как и в культуре фибробластов, мутаген подавляет митотическую активность и вызывает перестройки хромосом в клетках проростков.
2.    Обработка семян фосфемидом показала неоднородность зародышевых клеток в семенах Cr. capillaris в отношении стадий (фаз) митотического цикла. Частота перестроек хромосом повышается в зависимости от длительности его сохранения в семенах, т. е. от сроков фиксации после обработки и от сроков проклёва после обработки семян.
3.    Фосфемид вызывает перестройки в клетках проростков независимо от возраста обрабатываемых семян. Больше перестроек возникает при большей концентрации препарата.
4.    В высокой концентрации (1 · 1^—2M) фосфемид вызывал разрушение веретена деления и множественные разломы хромосом.