ЗАО «Вектор-Бест» (п. Кольцово)

Эта работа опубликована в сборнике "Науки  о  человеке":  материалы VI  конгресса  молодых  ученых  и  специалистов / Под  ред. Л.М. Огородовой, Л.В. Капилевича. – Томск: СибГМУ. – 2005. – 120 с.

Скачать сборник целиком

Материал и методы. В работе использовали два рекомбинантных HBcAg. Первый из них был получен в лаборатории Карпенко, он нами обозначен rHBcAg-K. Второй - коммерческий антиген (rHBcAg-C), который используется в производстве тест-систем.
Для определения специфичности гибридом использовали непрямой метод ИФА. В лунки полистироловых планшет сорбировали антиген rHBcAg. После блокировки мест неспецифического связывания забуференым раствором казеина (рН 7,2) в лунки добавляли пробы культуральных жидкостей (КЖ) и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. После промывки добавляли конъюгат антител (АТ) против иммуноглобулинов (Ig) мыши с ПХ ("ICN", США) на 30 минут при 37 °С.
Классы и подклассы Ig мыши определяли с использованием коммерческого набора ISO-2 ("Sigma", США). В лунках полистироловых планшет сорбировали АТ против одного из изотипов Ig мыши: IgG2a, IgG2b, IgG1, IgG3, IgM или IgA. После блокировки мест неспецифического связывания добавляли пробы КЖ и инкубировали в течение часа при 37°С. После отмывки добавляли конъюгат АТ против Fab -фрагмента Ig мыши с ПХ ("Sigma", США). Конкуренцию с сыворотками человека (ПоАТ), содержащими антитела против природного HBcAg, проводили следующим образом. В лунки полистироловых планшет с сорбированным rHBcAg-С добавляли 50 мкл сыворотки и 100 мкл КЖ в рабочем разведении (рабочее разведение подбиралось так, чтобы сигнал в ИФА в отсутствие ПоАТ составлял 2 о. е. при длине волны 450 нм). После инкубации реакционной смеси в течение часа при 37 °С планшеты отмывали и добавляли конъюгат анти - Ig мыши ("ICN", США) с пероксидазой хрена на 30 минут при 37 °С. Во всех иммуноферментных реакциях связывание пероксидазной метки с твердой фазой проявляли с помощью ТМБ. Считывание результатов проводили на длине волны 450 нм.

Результаты и обсуждение. Первым этапом нашей работы было изучение МКА из полученной против HВcAg-К коллекции в реакции с коммерческим rHВcAg-C. Выяснилось, что из 104 проб КЖ, которые показывают высокие титры антител с rHВcAg-К, 66% реагировали также и с HВcAg-C. Это указывает на степень сходства и различия между этими двумя антигенами. Известно, что рекомбинантные белки в большей или меньшей степени отличаются от природных аналогов и могут отличаться друг от друга. Для дальнейшей работы использовались МКА, которые реагировали с обоими рекомбинантными белками.
После проведённого анализа для клонирования нами были отобраны 5 гибридом: 4Е4, 9Е9, 9Е3, 7D5, 8D5. Для получения клонов-продуцентов моноклональных антител применяли метод лимитирующих разведений. Накануне клонирования готовили 96-луночные планшеты с перитонеальными макрофагами (клетками-кормилками). На следующий день клонировали отобранные гибридомы, рассевая по 10, 3 и 1 клетке в лунку. На 5-7 сутки подсчитывали количество лунок с 1 колонией. На 10 -14 сутки брали пробы КЖ из лунок с 1 колонией для анализа специфичности МКА. Основное анализируемое свойство - способность КЖ реагировать с HВcAg-C. Также исследовался изо-тип антител, содержащихся в КЖ, и свойства антител в конкуренции с поликлональными сыворотками человека, содержащими антитела к природному антигену.
Важным для получения МКА являются ростовые характеристики субклонов гибридом. Ряд субклонов погибали при пассировании в культуре. Одной из наиболее сложных для нас задач оказалось клонирование гибридомы 4Е4. При I клонировании все субклоны демонстрировали значительный разброс по величине сигнала. Кроме того, КЖ ряда лунок с 1 колонией показывали наличие антител изотипа IgG2a и IgM одновременно, в других присутствовали только IgG2a. Также наблюдался разброс по конкуренции с ПоАТ человека. КЖ, в которых была смесь изотипов АТ, показывали неудовлетворительную конкуренцию с ПоАТ человека. Клоны, синтезирующие IgG2a мыши, давали отличные показатели в конкуренции. Из этого можно предположить, что нужные нам АТ являются IgG2a. Два субклона 4Е4-14 и 4Е4-112, синтезирующие IgG2a, были взяты для дальнейшего реклонирования. Однако, при втором клонировании мы опять наблюдали разброс по величине сигнала и по уровню конкуренции с ПоАТ. При втором клонировании мы перестали выявлять антитела изотипа M. Только после четвертого клонирования нам удалось добиться однородности клонов по свойствам синтезируемых ими МКА. Все МКА субклонов 4-го клонирования давали высокие сигналы в реакции с rHBcAg-С, синтезировали IgG2a и показывали отличную конкуренцию с ПоАТ человека против природного HBcAg. Клон 4Е4-422 показал себя как моноклон и был наработан для получения асцитической жидкости (АЖ) на мышах линии BALB/c для получения конъюгата. Важно при этом, чтобы мыши были правильно подготовлены: с целью получения АЖ мышам вводят внутрибрюшинно за 3 - 5 недель до введения клеток гибридом 0,5 мл минерального масла пристана, что повышает способность гибридом расти в брюшной полости.
Примером легкого и успешного клонирования оказалась работа с гибридомой 9Е9. Клон 9Е9 уже при первом клонировании демонстрировал моноклональность и показывал наличие антител изотипа IgG2a и отличную конкуренцию с ПоАТ человека. Два его субклона клонировали еще раз, они также показали моноклональность и наличие антител изотипа IgG2a. Субклон 9Е9-12 был также наработан в АЖ.

Заключение. Таким образом, в нашей работе из коллекции гибридом, синтезирующих МКА против rHBcAg, были отобраны для клонирования 5 представителей, которые секретировали антитела с отличной конкуренцией с ПоАТ человека против природного HBcAg. Гиб-ридомы 4Е4, 9Е9, 9Е3, 7D5, 8D5 были клонированы до однородности. Нами показано, что для получения однородной популяции гибридом необходимо от 1 до 4-х шагов клонирования.