|
Научные руководители: канд. мед. наук Н.А. Малиновская, канд. мед. наук Г.А. Морозова, д-р мед. наук, проф. А.Б. Салмина, клин. орд. М.А. Фурсов
Красноярский государственный медицинский университет им. проф.В.Ф. Войно-Ясенецкого, г. Красноярск
Введение. На втором месте среди причин смертности человека, и одними из наиболее распространенных заболеваний зрелого, пожилого, а в последние десятилетия, и молодого возраста, являются острые нарушения мозгового кровообращения ишемического типа. В настоящее время тормозится прогресс в методах эффективной диагностики и лечения поражений центральной нервной системы вследствие недостаточной изученности клеточно-молекулярных механизмов повреждения головного мозга. При этом сравнительно недавно высказаны предположения о новых механизмах, играющих критическую роль в активации и функционировании нейроглиальных клеток в ответ на различные стимулы, с участием НАД+-зависимых путей метаболизма (пуринергические рецепторы, НАД+-метаболизирующие ферменты, протеинкиназы, НАД(Ф)Н-оксидаза) [3, 4]. Существуют изолированные сведения об особенностях экспрессии некоторых из указанных сигнальных молекул на клетках моноцитарно-макрофагальной природы, лейкоцитах, эпителио-цитах, нейронах, астроцитах и клетках микроглии, о роли Р2Х7 рецепторов и НАД+-гликогидролазы/ОЭ38 в регуляции внутриклеточного гомео-стаза кальция при воспалении; идентифицированы некоторые регуляторы экспрессии НАД+-гликогидролазы/ОЭ38 в клетках различной природы, синтезированы ингибиторы фермента и аналоги циклической АДФ-рибозы, тестируемые в настоящее время с целью направленной регуляции физиологических и патологических процессов [5].
АДФ-рибозилциклазная ферментативная активность CD38 контролируется многими факторами, в частности, структурой каталитического центра и сохранностью сульфгидрильных остатков цистеина в его пределах, уровнем внутриклеточных АТФ и НАДН, внутриклеточной локализацией фермента, конформационной пластичностью и способность формировать димеры в мембране для эффективного транспорта продукта реакции цАДФР, действием лигандов. Экспрессия АДФ-рибозилциклазы/ОD38 изменяется в процессе дифференцировки клеток и под действием физиологических и патологических стимулов. В частности, нами было показано ранее, что в клетках нейрональной природы активность фермента регулируется за счет активации мускариновых аце-тилхолиновых рецепторов и, что гамма-интерферон оказывает нейро-протективное действие на модели острой фокальной ишемии головного мозга при его превентивном внутрибрюшинном введении с растворителем в течение 3 дней до моделирования ишемии за счет направленного усиления экспрессии CD38 в очаге поражения [2, 5]. Однако, в свете получения новых данных о возможных нейротоксичных эффектах гамма-интерферона, продуцируемого активированный микроглией при дегенеративных патологиях ЦНС, как и в случае никотинамида, представляется познавательным изучение in vitro эффектов высоких дозировок гамма-интерферона, поскольку в протоколах нейропротекции зачастую используют высокие дозировки нейропротекторов.
Цель исследования. Оценить влияние гамма-интерферона на активность АДФ-рибозилциклазы и НАД(Ф)Н-оксидазы клеток головного мозга in vitro в физиологических условиях и при ишемии головного мозга.
Материал и методы. Объект исследования - крысы-самцы Wistar с моделью глобальной ишемии головного мозга (контрольная группа и 2 группы ишемии). Животные были разделены следующим образом: группа К (контроль) - интактные животные; группа И1 - моделирование ишемии головного мозга с забором материала через 24 часа с момента проведения операции, группа И2 - моделирование ишемии головного мозга с забором материала через 48 часов. Моделирование ишемии осуществлялось анестезированным животным (фторотан ингаляцион-но) путем экстравазальной билатеральной окклюзии общих сонных артерий по методу Eklof и Siesjo, 1972 [6]. У животных осуществлялся забор ткани из регионов головного мозга обоих полушарий, предварительно проведена оценка неврологического дефицита с помощью NSS-теста [1], а также когнитивной дисфункции с помощью теста «Водный лабиринт Морриса». Смертность животных после проведения операции вычислялась в процентах от общего числа крыс в группе. Детекция экспрессии CD38 клетками нейроглиальной природы проводилась на замороженных срезах лобных долей больших полушарий головного мозга согласно стандартному протоколу двойного непрямого метода иммуноги-стохимии. Люминесцентная микроскопия срезов проводилась при увеличении 900, фотографировались 10 полей зрения. С помощью разработанного программного обеспечения оценивалась относительная площадь экспрессии антигена CD38 клетками нейроглиальной природы в процентах от общей площади аутофлуоресцирующих клеток в каждом поле зрения и рассчитывалось среднее значение этого показателя по 10 полям зрения (в %). Модуляция экспрессии CD38 осуществлялась непосредственно между 2 и 3 этапами стандартного иммуногистохимического протокола гамма-интерфероном (препарат «Ингарон»). В гомогенатах ткани лобных долей больших полушарий головного мозга крыс определена активность АДФ-рибозилциклазы/ОD38 (согласно стандартному протоколу R.M. Graeff и др., в ед/мин/мг белка) и функциональная активность клеток нейроглии (главным образом микроглии, активность оценивалась по интегральным кривым кинетики их аутофлуоресценции при длине волны, соответствующей редокс-трансформации внутриклеточных пиридиновых нуклеотидов по оригинальной методике - Салмина А.Б., Салмин В.В., Лопатина О.Л. и др., в отн. ед.) флуориметрическим методом до и после модуляции функциональной активности гамма-интерфероном в концентрации 1000 МЕ/1 мл гомогената ткани.
Результаты и обсуждение. Использованные методы оценки неврологического дефицита подтвердили эффективность модели глобальной ишемии. Смертность животных в данной модели, имитирующей тяжелые повреждения головного мозга, составляла 50% в обеих группах с моделью ишемии головного мозга, что согласуется с литературными данными [6]. В контрольной группе смертности крыс не наблюдалось.
Анализ относительной площади ОЭ38-позитивных нейроглиальных клеток лобных областей больших полушарий головного мозга на замороженных срезах в процентах от общей площади нейроглиальных клеток выявил статистически значимое усиление экспрессии CD38 в клетках нейроглии при глобальной ишемии головного мозга в группах ишемии И1 (25,6±4,17) и И2 (26,0±4,05) в сравнении с группой контроля (16,0±1,8) без приложения модуляторов. Исследование изменения активности АДФР-циклазы при развитии глобальной ишемии головного мозга выявило статистически значимое (p<0,05) снижение активности этого фермента через 48 часов с момента развития ишемии головного мозга в группе И2 (0,01±0,002) в сравнении с группой К1 (0,42±0,269) при тенденции к ее снижению через 24 часа с момента развития ишемии (группа И1, 0,04±0,015). Эти данные согласуются с полученными нами ранее данными о динамическом характере изменения активности этого фермента при фокальной ишемии головного мозга у крыс. Характер постепенного снижения активности CD38 при развитии ишемии головного мозга, несмотря на усиление экспрессии этого фермента, скорее всего, связан с истощением работы фермента и, в целом, истощения функциональных ресурсов клеток нейроглии и/или снижением содержания НАД+, наблюдаемым в патогенезе ишемии головного мозга. Усиление экспрессии данного фермента, скорее всего, компенсаторная реакция организма в ответ на истощение ферментативных клеточных систем, что в условиях истощения внутриклеточного содержания НАД+ еще больше усугубляет истощение его функциональных резервов.
Исследование изменения функциональной активности нейроглии при развитии глобальной ишемии головного мозга выявило закономерности, сходные с активностью АДФР-циклазы клеток: наблюдалось ее снижение как через 24 (группа И1, 0,07±0,016), так и через 48 (группа И2, 0,07±0,019) часов с момента развития ишемии головного мозга в сравнении с группой К1 (0,29±0,182). Снижение функциональной активности клеток нейроглии (главным образом микроглии) согласуется с литературными данными об истощении «фагоцитарного резерва» у части клеток-фагоцитов, наблюдаемом в тесте с нитросиним тетразолием, в результате предшествующей пролонгированной активации фермента НАД(Ф)Н-оксидазы.
Приложение гамма-интерферона к гомогенатам ткани для изучения активности АДФР-циклазы во всех группах не вызвало статистически значимых эффектов, наблюдались лишь тенденции к снижению АДФ-рибозилциклазной активности CD38 в группе контроля К1 (0,03±0,009) и к ее усилению в группах И1 (0,08±0,051) и И2 (0,03±0,014). При модуляции функциональной активности нейроглии (главным образом клеток микроглии) наблюдалось статистически значимое усиление активности при приложении гамма-интерферона в группах И1 (0,31±0,031, p<0,05 в сравнении со значениями до модуляции) и И2 (0,36±0,101, p<0,05 в сравнении со значениями до модуляции) и тенденция к ее увеличению в группе К1 (0,66±0,274). Гамма-интерферон вызвал статистически значимое повышение экспрессии CD38 в группе контроля (49,2±6,75, p<0,05 в сравнении со значениями до модуляции) и тенденцию к ее повышению в группах И1 (42,9±6,66) и И2 (45,9±11,13), что указывает на возможную роль гамма-интерферона в регуляции экспрессии АДФР-циклазы/НАД+-гликогидролазы|Д1Ю38 в физиологичес-ких условиях, однако использование его как модулятора АДФР-циклазной активности при глобальной ишемии головного мозга без проведения дополнительных исследований с использованием больших статистических выборок не целесообразно. Для модуляции функциональной активности клеток нейроглии (главным образом микроглиальных клеток) при ишемии головного мозга возможно использовать гамма-интерферон.
Таким образом, получены данные, свидетельствующие об однонаправленном снижении активности ОD38/АДФ-рибозилциклазы (при усилении экспрессии CD38) и функциональной активности нейроглии (в основном микроглии) при ишемии головного мозга. Гамма-интерферон может являться in vitro модулятором экспрессии CD38 в физиологических условиях и активности НАД(Ф)Н-оксидазы клеток нейроглии при экспериментальной ишемии головного мозга.
Работа выполнена при поддержке гранта индивидуальных проектов молодых ученых КГАУ «ККФПН и НТД».
Список литературы:
1. Салмина, А.Б. Изменение активности АДФ-рибозилциклазы в клетках нервной системы коррелирует с развитием постишемической когнитивной дисфункции / А.Б. Салмина, Н.А. Шнайдер, С.В. Михуткина и др. // Международный неврологический журнал. - 2007. - №1 (11). - О. 71-78.
2. Фурсов, А.А. Профилактика постишемического неврологического дефицита путем модуляции экспрессии АДФ-рибозилциклазы в клетках головного мозга / А.А. Фурсов, А.Б. Салмина, В.А. Мороз и др. // Общая реаниматология. - 2007. -Т. 3, № 5-6. - С. 109-113.
3. Brough, D. Ca2+ stores and Ca2+ entry differentially contribute to the release of IL-1 beta and IL-1 alpha from murine macrophages / D. Brough, R. A. Le Feuvre, R. D. Wheeler et al. // J. Immunol. - 2003. - V. 170, №6. - P. 3029-3036.
4. Chiozzi, P. Spontaneous Cell Fusion in Macrophage Cultures Expressing High Levels of the P2Z/P2X7 Receptor / P. Chiozzi, J. M. Sanz, D. Ferrari et al. // J. Cell. Biol. - 997. - V.138, №3. - P. 697-706.
5. Higashida, H. Muscarinic receptor-mediated dual regulation of ADP-ribosyl cyclase in NG108-15 neuronal cell membranes / H. Higashida, S. Yokoyama, M. Hashii, M. Taketo, M. Higashida, T. Takayasu, T. Ohshima, S. Takasawa, H. Okamoto, and M. Noda // J. Biol. Chem. - 1997. - V. 272. - P. 31272-31277.
|
