Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск

НИИ медицинской генетики, г. Томск

Лаборатория популяционной генетики

Эта работа опубликована в сборнике статей по материалам 71-й итоговой научной студенческой конференции им. Н.И. Пирогова (г. Томск, 14-16 мая 2012 г.), под ред. В. В. Новицкого, Н.В. Рязанцевой. − Томск: Сибирский государственный медицинский университет, 2012. − 335 с. 

Скачать сборник (MS Word, 1 мб)

Скачать программу конференции  

Актуальность. В настоящее время накапливаются работы, посвященные установлению важности эпигенетических модификаций генома (модификация гистоновых белков, интерференция РНК и метилирование ДНК) в реализации и прогрессии фенотипов сердечно-сосудистых заболеваний. Один из подходов в решении данного вопроса представлен изучением статуса метилирования ДНК в тканях при патологии.

Наиболее вероятными кандидатами для тестирования нарушений статуса метилирования являются импринтированные гены, в том числе ген H19. В 5'-районе гена расположены дифференциально метилированные CTCF-связывающие сайты (DMR), которые контролируют его импринтинг и экспрессию. В соматических клетках на отцовском аллеле DMR регион метилирован, что предотвращает транскрипцию H19, в то время как на материнском - неметилирован и ген экспрессируется в клетках-потомках. Биаллельная экспрессия гена наблюдается в лейкоцитах периферической крови у больных с патологией почек и гипергомоцистеинемией (фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний). Увеличение экспрессии H19 также выявлено в тканях из области атеросклеротических бляшек человека. Однако исследования, посвященные анализу статуса метилирования гена Н19 в тканях сосудистой стенки у человека, ранее не проводились.

Цель. Оценить статус метилирования DMR региона гена Н19 в образцах тканей сонных артерий у больных атеросклерозом.

Материал и методы. Формирование репрезентативных выборок больных атеросклерозом проходило на базе ФГБУ 'НИИ комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний' СО РАМН (г. Кемерово). Всего в группу обследования вошли 54 русских мужчины (возраст 49-79 лет). Инсульт или транзиторные ишемические атаки в анамнезе регистрировались у 19 (35,2%) индивидов. Кроме этого, все 54 пациента имели ишемическую болезнь сердца и артериальную гипертензию, а у 24 (44,4%) из них диагностирована хроническая ишемия нижних конечностей.

Из биоптатов тканей сонной артерии, полученных в результате каротидной эндартерэктомии, был создан банк. У каждого больного взяты образцы из двух областей сосудистой стенки: атеросклеротическая бляшка и предлежащая макроскопически неизмененная ткань.

Для выделения ДНК из тканей сонных артерий использовался стандартный метод обработки протеиназой К и фенол-хлороформной экстракции.

Анализ статуса метилирования DMR региона гена Н19 проводился с использованием метода комбинированного бисульфит-рестрикционного анализа (СOBRA). Бисульфитная обработка ДНК производилась с использованием набора 'EZ DNA MethylationT Kit' ('Zymo Research', США) по стандартному протоколу производителя. Структура праймеров, которая использовалась для амплификации модифицированной ДНК, была опубликована в литературе ранее. Далее ПЦР продукт подвергали гидролизу рестриктазой Taq I ('Fermentas', Литва) при оптимальной для фермента температуре в течение 16 ч. Разделение продуктов реакции производилось в 3% агарозном геле с добавлением бромистого этидия. Детекция фрагментов ДНК осуществлялась в проходящем ультрафиолетовом свете с помощью гель документирующей установки 'Gel Doc 2000' ('Bio-Rad', США).

Результаты. В результате настоящего исследования не выявлено аберрантного метилирования DMR региона гена H19 в тканях из области атеросклеротических бляшек и предлежащей макроскопически неизмененной стенки сонных артерий у тех же самых больных.

Выводы. Таким образом, установлено, что статус метилирования DMR региона гена H19 не является важной детерминантой атеросклеротического поражения сосудов у человека.