Полное название:

ВЛИЯНИЕ АКТИВНОЙ АССОЦИАЦИИ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ И БИОГЕННЫХ ЭЛЕМЕНТОВ НА ДЕГРАДАЦИЮ НЕФТЕПРОДУКТОВ В ПОЧВЕ

Татарский государственный гуманитарно-педагогический университет (г. Казань)

Современное состояние окружающей среды различных стран и регионов обусловлено  природным и промышленным потенциалами, такими как машиностроение и металлообработка, химическая, нефтехимическая и нефтедобывающая промышленность. С их развитием увеличивается антропогенная нагрузка на экосистему, что приводит к загрязнению биосферы и ухудшению здоровья населения. При современном уровне развития  нефтедобывающей и нефтеперерабатывающей промышленности невозможно исключить воздействие нефти и продуктов её переработки на окружающую среду, что обусловливает необходимость применения методов и технологий, нейтрализующих это воздействие. Широкое применение биологических способов восстановления нефтезагрязненных почв и водоемов, включая производственные сточные воды, предопределяет задачу по выбору биопрепарата, эффективного в данных условиях. Нефтезагрязненные земли и водные объекты в результате аварий при траспортировке, неудачных эксплуатационных приемов добычи нефти и ее переработки и других причин наносит значительный ущерб экологии, рыбному и сельскому хозяйству. Очистка нефтезагрязненных земель, поверхностных и сточных вод наряду с механической, химической сорбцией, флотацией, коагуляцией, обратного осмоса представляет собой широкий комплекс мероприятий. Установлено, что микроорганизмы выступают в роли основных деструкторов разложения нефти. Практическое использование соответствующих микроорганизмов осуществляется путем внесения их в почву в форме различных препаратов. Несмотря  на наличие сегодня многих патентов и изобретений, решающих проблему очистки технологических нефтесодержащих стоков  отдельными группами микроорганизмов, работы по поиску активных, причем аборигенных культур бактерий с повышенной деструктивной активностью (при колебании температуры, рН среды и т.д.)., их всестороннему изучению и созданию новой системы их использования остается весьма активной и своеобразной. В виду этого, использование нефте – углеводородокисляющих микроорганизмов (УОМ) для очистки нефтезагрязненных земель, поверхностных и сточных вод является, бесспорно, эффективным. При этом используются различные роды, виды и штаммы микроорганизмов в качестве единственного средства окисления нефти и нефтепродуктов в почве или в воде – бактерии, из которых создаются ассоциации и консорциумы, а также биологические препараты.
Наиболее приемлемыми способами на современном этапе работ являются создание ресурсосберегающие биотехнологии, основанные на управляемом применении различных таксономических групп активных в окисление нефти аборигенных  микроорганизмов водных экосистем.
Загрязнение почвы нефтью и ее персистентными соединениями в районах добычи и переработки, как правило, имеет тенденцию к возрастанию. Причиной тому, аварийные ситуации и несоблюдение технологической дисциплины. На российских нефтепроводах ежегодно отмечается 50-60 тыс. случаев прорывов, "свищей" и пр., что приводит к значительным потерям нефти. Только на месторождениях Западной Сибири прорывы нефтепроводов случаются до 35 тыс. раз в год, в т.ч. до 300 официально регистрируемых аварий с выбросом нефти свыше 10 000 т в каждом случае [3]. Согласно другим показателям, потери нефтедобывающими и нефтеперерабатывающими предприятиями только на территории республик Татарстан, Башкортостан, Тюменской, Челябинской, Самарской и Оренбургской областей в период с 1978 по 1998г. превысила 20млн. т. А по данным Российского отделения «Гринпис» за 1995г. потеря нефти и нефтепродуктов за счет аварийных ситуации и несоблюдения технологической дисциплины в России достигло 25млн. т [4]. Экологическая проблема восстановления почв, загрязненных нефтью нефтепродуктами является крайне актуальной задачей. В связи с этим необходимо разработать эффективные способы восстановления продуктивности земель с применением бактериальных препаратов, полученных на основе аборигенных монокультур ускоряющих окисление углеводородов нефти и ее персистентных соединений. Микроорганизмы почвы являются единственными живыми существами способными использовать углеводород в качестве источника углерода и энергии. Нефть, попадая в почвенную и водную экосистему, привносит с собой разнообразный набор химических соединений, нарушающий сложившийся геохимический баланс. Нефтяное загрязнение глубоко изменяет отдельные звенья естественных биоценозов, создает новую экологическую обстановку с соответствующим  составом и числом организмов в почве. Первый техногенный «удар» при загрязнении нефтью наземных  экосистем (наряду с растительным покровом) принимают на себя верхние, самые ценные, обогащенные органическим веществом, корнеобитаемые горизонты почв, населенные разнообразными представителями биоты (бактериями, грибами, водорослями и животными).
Глубина просачивания нефти может ограничиваться только верхними горизонтами или достигать 0,2-0,5м. В песчаных почвах создается сплошной фронт продвижения нефти. В тяжелых суглинках нефть проникает по трещинам вдоль корневых систем растений, сорбируется в отдельных горизонтах, определяя мозаичную, пятнистую картину загрязнения почвенного профиля. Создаются своеобразные «нефтяные микротекстуры» почвенного профиля. Изменяется структура почвы в результате склеивания механических частиц и растительных остатков, вплоть до образования твердых покровов. Из-за этого кардинально меняется водно-воздушный режим почв. Происходят такие изменения при дозах нефти 150 мл/кг почвы и выше. Следствием нарушения аэрации является снижение окислительно-восстановительного потенциала и возникновение анаэробных условий в нефтезагрязненных почвах. Ограничение поступления кислорода замедляет разложение нефти в нижележащих горизонтах. При ограничении воздухообмена легкие углеводороды, которые являются высокотоксичными и трудно усваиваемые микроорганизмами, долго сохраняются в нижних слоях почвенного профиля в анаэробной  обстановке [6]. Нефтяное загрязнение вызывает массовую гибель почвенной мезофауны, приводит к потере продуктивности земель, деградации растительности, нарушает водно-воздушный баланс среды и организмов, обмен веществ и трофические связи.  Самоочищение и самовосстановление почвенных экосистем, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, это стадийный биогеохимический процесс трансформации загрязняющих веществ,  сопряженный со стадийным процессом восстановления биоценоза[6].   
Микробная деструкция углеводородов представляют ключевой механизм восстановления качества нефтезагрязненных почв. Среди микроорганизмов имеются формы, способные существовать за счет одних углеводородов. От других членов гетеротрофного микробиоценоза они отличаются двумя особенностями: возможностью поглощать гидрофобные соединения и способных в конструктивном и энергетическом обмене оксигенировать углеводородные субстраты, минерализовать их до диоксида углерода и воды или превращать в соединения, утилизируемые другими микроорганизмами.
Установлено, что углеводородокисляющие микроорганизмы широко распространены, но, особенно, их много в почвах и грунтах, где имеются газообразные и жидкие углеводороды. Развитие этих микроорганизмов может быть настолько интенсивным, что весь мигрирующий углеводородный поток (метана, пропана и других соединений) над нефтяной или газовой залежью практически полностью уравновешивается их окислительной активностью, создающей мощный микробный фильтр. Поэтому в случае загрязнения нефтяными углеводородами такие микроорганизмы получают преимущество, именно их размножением обусловлен эффект самоочищения почвы [1].
Литературные данные свидетельствуют о том, что ассоциации микроорганизмов способны более полно и быстро разлагать углеводородные субстраты по сравнению с индивидуальными штаммами [2,3,4]. Работы по использованию отдельных штаммов микроорганизмов в биодеградации нефтяных загрязнений в окружающей природной среде (почве, воде) носит пока поисковый характер.
В свете вышесказанного целью настоящей работы является, исследование в модельных экспериментах процессов биодеградации нефтезагрязненных почв активными аборигенными ассоциациями углеводородокисляющих микроорганизмов на фоне внесения минеральных удобрений (биогенных элементов). В свете вышесказанного целью наших исследований явилось изучение процессов восстановления нефтезагрязненной почвы на фоне применения отселектированных штаммов нефте- и углеводородокисляющих микроорганизмов с использованием биогенных элементов.
Попадая в почву, нефть заполняет поровое пространство, вытесняет почвенный воздух, то есть резко изменяет аэрацию почв. Образование битуминозной корки еще более ухудшает ее водно-воздушный режим. Происходит склеивание структурных отдельностей, заметно увеличивается вязкость и плотность почвенной массы [6]. Нефть, попадая в почву, нарушает адсорбцию, так как состав среды оказывает сильное воздействие на адгезию клеток, которая сильно зависит от концентрации и природы содержания в среде солей, ионной силы среды, pH среды, наличие макромолекул, органических веществ и тд. При разливах нефти на поверхность почвы глубина проникновения в почву зависит от ее влажности. При избытке воды в почве доступ кислорода затруднен, что приводит к снижению численности углеводородокисляющих микроорганизмов, а при недостатке происходит ограничение транспорта питательных веществ к клеткам бактерий [5]. Кроме того, происходит ухудшение питательных свойств, азотного режима, изменение кислотности почв, изменения всего комплекса биологических, химических, агрохимических показателей почвы, определяющие ее плодородие. Изменение почвенной биоты, загрязненной нефтью, характеризуется массовой гибелью фауны, но в последующем происходит увеличение микробиологической активности специализированных микроорганизмов. С одной стороны, нефть стимулирует рост определенных видов микроорганизмов, с другой – ингибирует.
Из анализа литературных источников можно выделить следующие способы рекультивации нефтезагрязненных почв: механические, физические, химические биологические.
В свете вышесказанного целью наших исследований явилось изучение процессов восстановления нефтезагрязненной почвы на фоне применения отселектированных штаммов нефте- и углеводородокисляющих микроорганизмов с использованием биогенных элементов.
Были использованы следующие почвы: чернозем, суглинистая, серая-лесная и песчаная. Варианты содержали сырую и товарную нефть, с товарного парка Мавринского УКПН Заинского НГДУ.
На первом этапе проводили опыты по изучению естественного восстановления суглинистой почвы от товарной и сырой нефти. Загрязнение нефтью близкое к аварийному составило 10 г/кг. Самоочищение почв от нефтяного загрязнения судили по динамике численности гетеротрофных микроорганизмов, путем высева почвенной суспензии на МПА и среду Мюнца.

 
В вариантах с внесением нефти наблюдали интенсивный рост численности микроорганизмов. Максимум, которого приходится на 19 день эксперимента в варианте с сырой нефтью и составило 586 тыс.кл/г почвы (рис 1). Незначительное развитие бактерий в первые дни опыта, вероятно связано с адаптацией последних к изменившимся условиям среды при внесении в нее нефти. Отмечен интенсивный рост численности микроорганизмов с 3 по 19 день, обусловленный  активным потреблением  вносимого субстрата – нефти.
Самое лучшее развитие микрофлоры отмечено в варианте с внесением сырой нефти, которое составило 586 тыс. кл/г,что на порядок выше чем в варианте с товарной нефтью 479 тыс.кл/г. В то время как в контрольном варианте отмечаемая численность поднялась от 10 до 390 тыс. кл/г. 

Таблица 1

Результаты фитотестирования суглинистой почвы

Вариант	Число проростков, шт. (%)		Показатели растений овса относительно контроля, %
	посеянных	выросших	Длина корней	Длина проростков
Контроль	50	10 (20)	100 (12,4)	100 (35,7)
Почва + товарная нефть	50	23 (46)	101,6 (12,6)	95,2 (34,0)
Почва + сырая нефть	50	20 (40)	125,8 (15,6)	102 (36,4)

 

Проведенное фитотестирование показало (таб.1), что высокая численность гетеротрофных микроорганизмов способствовала очистке почвы от нефти. В варианте с сырой нефтью длина корней растений овса соответствовала таковым показателям в контроле и даже превысила их на 2 %, что говорит об очистке почвы на 100 %.
Таким образом, можно сделать вывод, что в вариантах с внесением сырой нефти интенсивность очищения почвы прошла лучше, чем в варианте с товарной нефтью, что подтверждают результаты фитотестирования. Данные результаты можно объяснить различием составов вносимых нефтей, то есть содержание трудноразлагаемых фракций в товарной нефти больше, и к тому же в сырой нефти большое содержание воды. Проведенный опыт позволяет установить наличие определенного потенциала самоочищения почвы от нефти.
На втором этапе эксперимента была проведена работа по подбору оптимальных доз внесения минеральных удобрений в исследуемой почве, с целью интенсификации процесса биодеградации нефти.                
Для эксперимента использовали комплекс минеральных удобрений, (аммиачная селитра, двойной суперфосфат, калий сернокислый) в количестве от 30-100 мг/кг по действующему веществу.
Аналогично с первым экспериментом отмечалось интенсивное развитие микрофлоры во всех вариантах. Особое внимание обращает на себя варианты с внесением минеральных удобрений, в которых уже на 7 день эксперимента отмечались высокие показатели численности гетеротрофных микроорганизмов (рис.2). Наилучшие показатели наблюдали в варианте с внесением комплекса минеральных удобрений в количестве 40:50:45 мг/г, где общая численность микроорганизмов составила 910 тыс. кл/г. В то время как в варианте без внесения удобрений период адаптации почвенной микрофлоры к загрязнению, был более длителен.
Общая численность гетеротрофных микроорганизмов в контроле составила от 660 тыс. кл/г максимум, которого приходится только на 20 день опыта. То есть можно констатировать, что внесение комплекса минеральных удобрений способствовало более быстрой адаптации микроорганизмов к внесенному субстрату. Внесение минимальных и максимальных доз минеральных удобрений также способствовало лучшему развитию микроорганизмов.
 

 

Анализ остаточных углеводородов подтверждает, что лучшая концентрация минеральных удобрений 40 : 50 : 45, где степень десирукции нефти составила 56 %, по сравнению с контролем 43 % и вариантов  минимальным и максимальным внесением NPK 53 % и 54 % соответственно.
Через месяц было проведено фитотестирование, которое подтверждает лучшую очищенность почвы в варианте с внесением комплекса удобрений с концентрацией 40-50-45. В данном варианте наблюдали лучшие показатели растений овса, как длины проростков, так и длины корня.
Длина корней составила 9,8 см, что превышает длину корней вариантов с минимальным и максимальным внесением удобрений на 1,7 см и 2,4 см соответственно.
 Таким образом, в ходе эксперимента было выяснено, что наилучшей концентрацией для роста и развития гетеротрофной микробиоты является концентрация NPK 40 : 50 : 45. В этом варианте остаточное содержание углеводородов превысило показатели остальных вариантов в среднем на 5 %.
Помимо внесения минеральных удобрений перспективным направлением в биологической рекультивации является интродукция отселектированных УОМ [1, 4].
На третьем этапе для оптимального восстановления почв от нефти использовали УОМ .
Проведены опыты с внесением 1 и 10 культур микроорганизмов. Для поддержания численности  естественных и вносимых микроорганизмов применяли комплекс минеральных удобрений оптимальной концентрации установленной в предыдущем опыте. Наряду с этим были заложены варианты с аэрацией.
 

 

Анализ динамики численности микроорганизмов показал, что лучшее развитие микрофлоры особенно наглядно видно в варианте с внесением 10 культур, в котором уже на 7 день эксперимента численность достигла 829 тыс. кл/г и оставалась высокой вплоть до 21 дня эксперимента. Варианты с внесением только культуры Pseudomonas также характеризуется быстрой адаптацией бактерий к нефти. Дополнительная аэрация значительно повлияла на развитие, как при внесенной, так и аборигенной микрофлоры исследуемой почвы. Контрольный вариант характеризуется меньшими значениями общей численности бактерий, с большим периодом адаптации к измененным условиям. В то время как в варианте с внесением NPK интенсивный рост сохраняется до 25 дня эксперимента, что опять подтверждает предыдущий опыт о благоприятном влиянии минеральных удобрений на поддержание жизнедеятельности почвенной микробиоты.
 Самая высокая степень деструкции нефти в почве составила 65 % в варианте с внесением 10 культур и периодической аэрации, что на 8 %  больше, чем в варианте с 1 культурой. Степень деструкции нефти в этом варианте превысила контроль на 12 %.

Результаты фитотестирования, подтверждают лучшее развитие растений в вариантах с внесением 10 культур и аэрацией, где длина проростков составила 19,5 см, что превышает вариант без аэрации на 3,6 см, а длину корней на 4,3 см.
Таким образом, на основании проведенных исследований можно сделать вывод, что внесение отселектированных культур микроорганизмов позволят повысить интенсивность процесса биодеградации нефти в почве. При внесении 10 культур степень деструкции нефти составила 65 %, чем в варианте с 1 культурой. Важным фактором является внесение комплекса минеральных удобрении и проведение систематического рыхления.
В лабораторных условиях был поставлен модельный эксперимент при температуре 20-230С и влажности 60% от полной влагоемкости. Почву искусственно загрязняли нефтью (10 г/кг), а так же вносили комплекс биогенных элементов, концентрацию которых определили в предыдущих экспериментах. Определение численности микроорганизмов проводили общепринятыми методами посева почвенной суспензии на мясопептонный агар (МПА). Повторность опытов трехкратная.
 

Микробиологический анализ показал, что в образцах загрязненной почвы изначально присутствовала аборигенная микробиота численность, которой на порядок повысилась через 10 суток после загрязнения почвы нефтью. В вариантах с внесением биогенных элементов, численность УОМ возрастала в большей степени и сохранялась на высоком уровне. Отбор проб через пять дней показал, что численность микроорганизмов резко возросла от 6×105 до 12×105 (рис.1). В варианте с 10 видами жидкой культуры нефть разлагалась интенсивнее и на десятый день исследований численность достигла отметки 13×105, в дальнейшем происходит интенсивный спад численности бактерий. После загрязнения почвы нефтью через десять суток было замечено незначительное снижение ее содержания по сравнению с исходным. Схожая картина наблюдается в варианте, где присутствует 1 культура с еще большим снижением численности к двадцатому - двадцать пятому дню опыта до 4×105. Вариант с 3 видами бактерий достиг высокой численности к десятому дню и составил 10×105 клеток. Нельзя упускать из виду, что добавление биологических элементов ускорило процесс разложения нефти. Численность в контрольном варианте продолжала возрастать на протяжении всего эксперимента и к двадцатому дню достигла 8×105 клеток.
 

 

С течением времени происходит восстановление общего микробного ценоза. Выяснено, что обработка загрязненной почвы жидкой культурой бактерий стимулировала рост бактериального сообщества, а совместное внесение микроорганизмов с азотными удобрениями привело к резкому возрастанию численности. В соответствии с увеличением численности микроорганизмов, в особенности с ростом углеводородокисляющих бактерий уменьшилось содержание остаточных углеводородов нефти (рис.1). Если в контрольном варианте максимум численность составила  8×105 клеток, то в вариантах с внесением жидкой культуры бактерий эти показатели были намного выше, что значительно ускорило деструкцию нефти.
Таким образом, введение биопрепаратов содержащих активную биомассу и азотно-фосфорные удобрения поможет определить оптимальные пути рекультивации загрязненных  нефтью и нефтепродуктами почвенных экосистем.

Выводы
1.    Площади нефтезагрязненных земель в Росси нуждающихся в восстановлении плодородия составляет более 800 тыс. га в год. Поэтому проблема очистки почв от нефти и нефтепродуктов достаточно актуальна.
2.    Нефть и нефтепродукты отрицательно влияют на естественные свойства почвы: изменяется соотношение между C : N, ухудшается аэрируемость почвы и т.д.
3.    Перспективным методом рекультивации почвы то нефти является биологический метод, основанный на внесении биопрепаратов и биодобавок обеспечивающих эффективное восстановление нефтезагрязненных земель.
4.    Выявлено, что внесение минеральных удобрений для стимуляции аборигенной микрофлоры исследуемой почвы является концентрация NPK 40 : 50 : 45. Степень деструкции нефти в этих вариантах за 30 дней составила 56 %.
5.    Установили, что внесение 10 видов отселектированной углеводородокисляющей культуры микроорганизмов в количестве 106 тыс. кл/г совместно с минеральными добавками способствовало очищению суглинистой почвы на 65 %. При интродукции культуры рода Pseudomonas на фоне внесения комплекса NPK деструкция нефти составила 57  %. Проведение систематического рыхления почвы повысило процент биодеградации нефти на 3 – 5 %.

Литература
1.    Живонос Н.В. Изменение численности физиологических групп почвенных микроорганизмов и биологической активности почв, под влиянием различных вариантов рекультивации почв//Наука и образование ХХI века: Сборник тезисов докладов Второй окружной конференции молодых ученых ХМАО. Ч. 1. Сургут: Изд-во СурГУ, 2001. - С.14-16.
2.    КашаевР.С. Автоматизированная информационно-аналитическая система контроля окружающей среды // Экология. 2004. №6. - С.30-38.
3.    Молотков И.В., Касьяненко В.А. Рекультивация нефтезагрязненных почв // НефтьГазПромышленность. 2005. - С.307-311.
4.    Морозов Н.В. Экологическая биотехнология: очистка природных и сточных вод макрофитами. Казань: издательство КГПУ, 2001.-361с.
5.    Пинтус И.Ф., Филонов А.Е., Кошелева И.А., Гаязов Р.Р., Карпов А.В., Боронин А.М,  Выделение и характеристика микроорганизмов-деструкторов полициклических ароматических углеводородов//Микробиология.-1997.- Т.66, №2.- С.269-272
6.    Солнцева Н.П. Общие закономерности трансформации почв в районах добычи нефти (формы проявления, основные процессы, модели)//Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем.- М.: Наука, 1988.-С.23-42