Нижегородская государственная медицинская академия

Эта работа опубликована в сборнике научных трудов «Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии» (2004 год, выпуск 1), под редакцией проф., д.м.н. Ильинских Н.Н. Посмотреть титульный лист сборника

 В настоящее время отмечается рост кандидозных оппортунистических инфекций среди населения [1,2], при этом основным патогеном является Candida albicans [3]. Адгезия C. albicans на эпителиоцитах является начальным этапом развития кандидоза. При этом, на реализацию адгезивного потенциала в системе "кандиды - эпителиоциты" могут оказывать влияние многие факторы, как со стороны кандид, так и со стороны организма хозяина [3]. Воспаление является обязательным атрибутом кандидоза. Поэтому сывороточный экссудат, представляя неотъемлемый компонент воспалительного процесса, может существенно влиять на его развитие, оказывая воздействие на адгезивные реакции кандид в системах с эпителием.
Целью настоящего исследования является изучение гуморальных факторов сыворотки, способных влиять на адгезию в системе «Candida albicans – буккальные эпителиоциты».
Материалы и методы. В работе использовали штамм C. аlbicans 601 (НИИ гигиены и профпатологии МЗ РФ, Н.Новгород) Культуру C. albicans получали в дрожжевой фазе на агаре Сабуро (24 ч, 37С). Посевы смывали забуференным физиологическим раствором (ЗФР), отмывали десятикратным объемом, удаляли клеточные агрегаты центрифугированием (40g, 2 мин) и ресуспендировали, в зависимости от эксперимента, в ЗФР в концентрации 107 – 109 клеток/мл. Клетки буккального эпителия получали от здоровых доноров 18-20 лет, утром, натощак, с внутренней поверхности щеки, дважды отмывали ЗФР (40g ,5 мин) и готовили взвесь с концентрацией 106 кл/мл. Равные объемы (по 0,5 мл) взвеси эпителиоцитов и кандид инкубировали в течение 30 мин при 370С в растворе Хенкса без фенолового красного, встряхивая каждые 5 мин. Эпителиоциты трехкратно отмывали ЗФР от не прикрепившихся кандид (40g, 5 мин). Из осадка клеток готовили мазок, который после фиксации этанол-эфирной смесью окрашивали 0,25% раствором азура А. Определяли индекс адгезии, т.е. среднее количество кандид в пересчете на один эпителиоцит (учитывали 100 клеток). К осадку кандид (107 клеток) добавляли 0,5 мл свежего пула сывороток от 10-15 доноров, инкубировали при 37°С, 30 мин, отмывали десятикратным объемом ЗФР и после инкубации с буккальными эпителиоцитами оценивали результат. В ряде опытов, с целью удаления антител, сыворотку истощали микробной взвесью в режиме, исключающем активацию комплемента. Для этого 0,5 мл сыворотки инкубировали 30 мин при 40С с центрифугатом микробных клеток (109 клеток) и после центрифугирования (4000g, 20 мин) использовали в опытах. Изучение влияния комплемента на адгезивные реакции кандид проводили с истощенной сывороткой, в которую добавляли ингибиторы, полностью подавляющие активацию комплемента (0,01М ЭДТА) или оставляющие возможность только для альтернативной пути активации (0,01M МgCl2-0,01M ЭГТА) [4]. Для удаления нековаленто-связанных компонентов сыворотки, кандиды после инкубации с исследуемыми субстратами, трижды отмывали десятикратным объемом ЗФР, смешивали в равных объемах (0,5 мл) с 0,1% водным раствором додецилсульфата натрия (ДДС) [5] при постоянном перемешивании (200С, 10 мин, 6•100 мин-1) на термомиксере, затем отмывали и ресуспендировали в ЗФР. Контролем служили интактные кандиды, обработанные ДДС.
Результаты и обсуждение. Пул сыворотки вызывал снижение адгезии кандид на буккальных эпителиоцитах в 3,6  0,18 раза (р< 0,05). После обработки кандид сывороткой, истощенной (4°С, 30 мин) микробной взвесью C. albicans, наблюдали менее выраженное снижение адгезивного эффекта - 2,0 ± 0,1 (р < 0,05). Это говорит о том, что антитела вносят существенный вклад во взаимоотношения кандид с буккальными клетками, отвечая примерно за 22 % антиадгезивного эффекта.
Для изучения природы антитело-независимых факторов, проводили обработку кандид при 37ºС и 4ºС сывороткой, истощенной по антителам. Определяли вклад истощенной сыворотки в торможение на адгезии кандид на буккальных клетками и сравнивали с показателями экспериментов с цельной сывороткой при тех же режимах. Антиадгезивный эффект истощенной по антителам сыворотки при 4°С был минимальным 12,3 ± 1,4 %, в то же время для цельной сыворотки те же показатели были гораздо выше: 54,6  2,7 %. При 37°С антидгезивный эффект истощенной сыворотки был намного выше 55,8 ± 2,2 % и приближался к показателям цельной сыворотки- 73,5  1,4 %. Это говорило о том, что в истощенной по антителам сыворотке содержатся факторы, действие которых на кандиды проявляется при 37°С. Обработка 0,1 % ДДС удаляла нековаленто связанные компоненты, но не устраняла антиадгезивный эффект истощенной сыворотки, что указывало на то, что действие этих факторов вызывает необратимые изменения в адгезивном аппарате кандид. Можно было думать, что такой эффект оказывают компоненты системы комплемента, которые в процессе активации подвергаются ковалентному связыванию с объектами.
Для изучения влияния комплемента проводили опыты с истощенными по антителам сыворотками, как содержащими активные фракции комплемента, так и с заблокированными механизмами активации комплемента. Эксперименты показали, что температурозависимые компоненты в истощенной сыворотке не относились к системе комплемента.
Выводы. Таким образом, нормальная сыворотка крови человека обладает двумя группами факторов, тормозящих взаимодействие кандид с буккальными клетками. К первой из них относятся антитела, другая часть представлена температурозависимыми факторами, не связанными с системой комплемента и способными вызывать структурные изменения адгезивных молекул кандид.

Литература:
1.    Лесовой, В.С. Кандидоз ротовой полости (обзор) / В.С. Лесовой, А.В. Липницкий, О.М. Окчурова // Проблемы медицинской микологии.-2003.-Т.5, № 1. – С. 21-24.
2.    Сергеев А. Ю. Кандидоз / А. Ю. Сергеев, Ю.В. Сергеев. М: Триада-Х. 2001.- 472с.
3.    Cannon, R.D. Oral colonization by Candida albicans / R.D. Cannon, W.L. Chaffin. // Crit. Rev. Oral. Biol.-1999. –Vol. 10, № 3.- P.359-383.
4.    Kozel, T. R. Activation and binding of C3 by Candida albicans / T. R. Kozel, R. R. Brown, G. S. Pfrommer // Infect. Immun. -1987. - Vol. 55. -P.1890-1894.
5.    Kozel, T. R. Distinct characteristics of initiation of the classical and alternative complement pathways by Candida albicans / T. R. Kozel., L. C. Weinhold, D. M. Lupan // Infect. Immun. -1996. -Vol. 64. -P. 3360-3368.