ФГУН Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микрибиологии Роспотребнадзора, (г.Казань)
В последнее десятилетие проблема внутрибольничных инфекций (ВБИ) приобрела исключительно большое значение для всех стран мира. Это обусловлено, прежде всего, значительным ростом числа госпитальных штаммов микроорганизмов, обладающих устойчивостью к широкому кругу антимикробных препаратов. Среди возбудителей ВБИ одно из первых мест принадлежит микроорганизмам рода Staphylococcus, наиболее патогенным представителем которого является S. aureus. Эпидемиологическая ситуация осложняется в связи с широким распространением в стационарах, а также появлением и во внебольничной среде, клинических изолятов S. aureus, устойчивых к оксациллину (ORSA или MRSA). MRSA способны вызывать разнообразные клинические формы внутрибольничных инфекций, включая наиболее тяжелые, такие как: бактериемия, пневмония, синдром септического шока, септический артрит, остеомиелит и другие, которые требуют длительного и дорогостоящего лечения. Показано, что рост частоты ВБИ, наблюдаемый в стационарах различных стран мира, обусловлен распространением эпидемических штаммов MRSA, многие из которых способны вырабатывать пирогенные токсины - суперантигены, подавляющие иммунный ответ на S. aureus. Совершенствование методов эпидемиологического и микробиологического мониторингов, направленных на выявление эпидемически значимых штаммов, приобретает все более актуальное значение.
MRSA имеют свои биологические особенности. Во-первых, уникальный биохимический механизм резистентности к метициллину обеспечивает им устойчивость ко всем полусинтетическим пенициллинам и цефалоспоринам. Во-вторых, такие штаммы способны "аккумулировать" гены антибиотикорезистентности и поэтому нередко обладают устойчивостью к нескольким классам антимикробных препаратов одновременно, тем самым значительно затрудняя лечение пациентов. И, наконец, в-третьих, такие штаммы способны к эпидемическому распространению, вызывают тяжелые формы внутрибольничных инфекций.
Многие эпидемические штаммы MRSA продуцируют пирогенные токсины, обладающие суперантигенной активностью (PTSAgs). Они являются причиной или осложняют патогенез острых и хронических заболеваний человека. Гены, детерминирующие синтез PTSAgs, могут находиться на мобильных генетических элементах (бактериофагах, "островах патогенности") в составе хромосомы MRSA.
Устойчивость метициллинрезистентных штаммов золотистого стафилококка (MRSA) к бета-лактамным антибиотикам обусловлена продукцией дополнительного пенициллинсвязывающего протеина - ПСБ-2', отсутствующего у чувствительных микроорганизмов. Синтез ПСБ-2' кодируется геном mecA, расположенным на хромосоме S. aureus, в специфической области, обнаруживаемой только у метициллинрезистетных штаммов стафилококка - mec ДНК. Mec ДНК представляет новый класс мобильных генетических элементов, который получил название стафилококковая хромосомная кассета mec (Staphylococcal chromosomal cassette mec = SCCmec). Выявлено существование 4 типов SCCmec, различающихся как размерами (от 21 до 66 т.п.н.), так и набором генов, составляющих данные кассеты. Уникальность метициллинрезистентности заключается также и в существовании феномена гетерорезистентности, суть которого состоит в том, что в условиях инкубации при 37°C не все клетки популяции проявляют устойчивость к оксациллину.
Большинство штаммов Staphylococcus spp. содержат в геноме плазмидную ДНК. Размер плазмид, содержащихся в геноме штаммов стафилококков, составляет от 1 до 60 kb. Плазмиды, как правило, содержат гены, обуславливающие устойчивость бактериальных клеток к антибактериальным препаратам, тяжелым металлам, антисептикам и четвертичным аминам. Некоторые плазмиды несут гены кодирующие ферменты и гены, ответственные за процесс конъюгации. Изоляты S. aureus, выделяемые из клинического материала, а также от амбулаторных пациентов очень часто содержат более одной плазмиды. По классификации предложенной Novick R.P. выделяют три класса стафилококковых плазмид, которые различаются по массе и копийности в бактериальной клетке. Так к I классу относят небольшие (1-5 kb), мультикопийные (15-60 копий на клетку) плазмиды, которые вносят детерминанты первичной устойчивости к тетрациклину (например рТ181, рТ127), хлорамфениколу, стрептомицину, эритромицину и другим антибактериальным препаратам. К II классу относят средние по величине (15-30kb), низкокопийные (от 4-6 копий на клетку) плазмиды, с которыми у золотистого стафилококка связана комбинированная устойчивость к β-лактамным антибиотикам, а также к макролидам и различным неорганическим ионам. К III классу относят большие стафилококковые плазмиды, порядка 30-60 kb, в основном, содержат детерминанты конъюгативного переносчика (tra) и несколько дополнительных детерминант комбинированной устойчивости к гентамицину, пенициллину и четвертичным аминам. В связи с недостаточной изученностью распространённости циркуляции неинтегрированных плазмид, среди клинических изолятов стафилококков в нашей работе проведено исследование циркуляции неинтегрированных плазмид у клинических штаммов стафилококков (S. aureus, S. epidermalis), выделенных со слизистой и кожи пациентов с различными аллергическими заболеваниями (атопический дерматит, аллергический ринит, атопическая бронхиальная астма).
Материалы и методы. Исследовано 29 штаммов S. aureus (с кожи и слизистой носа) и 25 штаммов S. epidermidis (с кожи) полученных из коллекции лаборатории микробиологии ФГУН КНИИЭМ. Все штаммы были изолированы и идентифицированы от амбулаторных пациентов с атопическим дерматитом и аллергическим ринитом за последние 5 лет. Неинтегрированную плазмидную ДНК (пДНК) получали по протоколу к коммерческому набору для выделения пДНК AxyPrep Plasmid Miniprep Kit (Axygen biosciences, USA) из бактериальной биомассы, которую отделяли от жидкой питательной среды центрифугированием при 12,000 rpm в течение 1 минуты. Элюцию очищенной пДНК с сорбента проводили деионизированной водой. Полученные препараты пДНК электрофорезировали в 0,8% агарозном геле. Плазмидные профили визуализировались трансиллюминатором ECX-15M, Vilber Lormat, Франция, при УФ облучении геля, в качестве интерколирующего красителя использовали бромистый этидий и фотодокументировались видеосистемой «Gel Imager 2». Вычисление молекулярной массы проводили по стандарту молекулярной массы с применением набора из двух маркёров: 1Kb Ladder DNA marker (300 bp-10000 bp), и 100bp Ladder DNA marker (100 bp-3000 bp) «Axygen biosciences». Фенотипическую устойчивость клинических штаммов стафилококков к антибактериальным препаратам оценивали на основании дискодиффузионного метода согласно регламентированному Федеральным центром Госсанэпиднадзора Минздрава РФ, 2004 г. (МУК 4.2.1890-04).
Результаты и обсуждение. В результате работы нами проанализировано 54 штамма стафилококка. У 30,0% были выделены плазмиды размер, которых составил 10.000 bp (рис.1). Данный тип плазмид был отнесён нами ко второму классу, как низкокопийные средние по величине плазмиды. Штаммы бактерий (S. aureus – 10 и S. epidermidis - 6), содержащие эти плазмиды, в отличие от плазмидо-негативных штаммов, характеризовались полирезистентностью к оксацилину, β-лактамным антибиотикам и азитромицину. Все штаммы S. aureus, несущие данные плазмиды фенотипически являлись метицилин-резистентными штаммами.
Рис.1. М-маркер (1Kb Ladder DNA marker); 1-штамм S. aureus № 62; 2-штамм S. Aureus № 280
