РЕЗЮМЕ

Методы протеомики использованы для изучения влияния паратиреоидного гормона (ПТГ, фрагменты 1-34) на остеобласты как главные компоненты ниши гемопоэтических стволовых клеток. Обнаружено, что ряд белков изменяется в ответ на обработку ПТГ в течение 4, 8 и 32 часов. Оптимизирован протокол для систематической идентификации изменения уровня белков при взаимодействии клеток с их окружением

Ключевые слова: протеомика, ниша гемопоэтических стволовых клеток, паратиреоидный гормон, остеобласты

1. ВВЕДЕНИЕ

Известно, что компоненты т.н. «ниш» стволовых клеток [1] определяют их функциональное состояние и, в частности, препятствуют потере высокого пролиферативного потенциала. Установлено, что важным структурным элементом ниш являются остеобласты, количество и активацию которых можно регулировать с помощью паратиреоидного гормона (ПТГ). Остеобласты стимулируются ПТГ или локально образующимся связанным с ним белком (PTHrP) через рецептор (PPR) к ним [2, 3].

В ряде экспериментов показано, что после инъекций небольших количеств ПТГ, сопоставимых с используемыми для лечения остеопороза, число самых ранних полипотентных гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) увеличивается в 2 раза, а мыши, восстанавливающиеся после летального облучения под действием костного мозга, обработанного ПТГ, лучше выживают [4].

Этот эффект, видимо, связан с повышением экспрессии Jagged 1 - лиганда, локализованного на поверхности остеобластов, который взаимодействует с рецептором Notch 1, экспрессированным на поверхности ГСК [5]. Такое взаимодействие стимулирует пролиферацию ГСК.

В то же время молекулярные механизмы взаимодействия ПТГ и остеобластов остаются малоизученными, что не позволяет в должной мере  интерпретировать влияние последних на ГСК.

В этой связи целью нашего исследования явилось, во-первых,  выявление белков остеобластов, изменяющихся под действием гормона, являющегося, по сути дела, связующим звеном между остеобластами как компонентами ниши, и находящимися в ней ГСК. Во-вторых, нами предпринята попытка оптимизации инструментария протеомики, позволяющего более эффективно готовить образцы для анализа и изучать поведение белков клеток в динамике.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В экспериментах использована клеточная линия остеобластподобной остеосаркомы MG63 человека в качестве модели для исследования эффектов ПТГ - фрагмента человеческого ПТГ с аминокислотами 1-34 (Sigma-Aldrich). Клетки культивировали в среде Dulbecco‟s Modified Eagle‟s  (DМЕМ), содержащей 10% эмбриональную бычью сыворотку, 1% L-глутамин, 1% антибиотик-антимикотик и 1%  заменимых аминокислот (все - Invitrogen) в 5% СО₂ инкубаторе при т-ре 37°C. По достижении 70%-ой конфлуентности клетки были перенесены в «обедненную» среду 0,1% Fetal Bovine Serum (FBS) на 48 часов для синхронизации в  фазе G1  перед добавлением 10^-7М ПТГ или контрольного солевого раствора.

Активированная флуоресценцией сортировка клеток (FACS) была использована для контроля содержания ДНК с целью определения степени G0/G1 синхронизации в клеточной популяции. Это необходимо для подтверждения того, что наблюдаемые молекулярные изменения вызваны условиями эксперимента, а не различиями между клетками, находящимися на разных стадиях клеточного цикла.

Процедура FACS. Клетки, зафиксированные 70% этанолом, дважды промывали фосфат-цитратным буферным раствором и ресуспендировали в 50 микролитрах 100 мкг/мл РНКазы-А (Sigma) и 300 мкл 50 мкг/мл пропидиум-иодида (Sigma) и инкубировали  при комнатной температуре в течение 30 мин. Общее количество клеток (10000 на популяцию) анализировалось с помощью  FACSvCalibur проточного цитометра (Becton Dickenson) и маркеры клеточного цикла использовались для построения гистограмм  содержания ДНК с помощью компьютерного пакета CellQuest Pro Software, позволяющего оценивать пропорции клеток в G0/G1, S и G2/M фазах клеточного цикла.

FACS-анализ использовался также для определения, индуцирует ли более длительное «голодание» апоптоз в контрольных клетках (через 32 часа), и стимулирует ли обработка  ПТГ голодающих MG63 клетки (также через 32 часа) к новому вступлению в клеточный цикл.

Примерно 3х10⁶  клеток были взяты через 4, 8, и 32 часа после взаимодействия с ПТГ и из контроля и  хранились, при необходимости, при -80°C. Затем клетки лизировали ультразвуком. Экстрагирование белков проводили с помощью набора реагентов ProteoExtract® Subcellular Proteome Extraction Kit (S-PEK, Calbiochem, Germany). Набор Clean-Up (Amersham Biosciences) использовался для удаления примесей перед загрузкой на 2-D гель-электрофорез в первом направлении. Концентрация белка количественно определялась с помощью набора ВСА (Pierce). Лизаты (50 мг белка) наносились на обезвоженные IPG–стрипы с помощью прибора IPGphor II (GE- Healthcare).

Для воспроизводимого 2-D гель-электрофореза использовалась оптимизирующая процесс гель-система Criterion (Bio-Rad). Сравнение ПТГ-стимулированных и нестимулированных клеток проводилось при их окрашивании красителем Imperial™ (ThermoFisher Scientific). Визуализация окрашенных гелей проводилась с помощью прибора Dyversity (Syngene).

Детектирование белковых пятен и компьютерный анализ изображений осуществлен с помощью  программы 2D Evolution/SameSpots  (Nonlinear Dynamics). Для идентификации белков пятна вырезали вручную или автоматически с помощью робота Gelpix (Genetix) с последующей трипсинизацией. Идентификация белков проводилась общепринятым методом времяпролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF). Полученные пептиды анализировались на MALDI масс-спектрометре (MicroMass). Спектры получали в режиме отражения и обрабатывали при помощи программы Mascot. Поиск по “пептидному фингерпринту” проводился в базе данных NCBI.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

  В соответствии с полученными результатами, 48-часовое голодание было достаточным для синхронизации MG63 клеток в стадии G0/G1 клеточного цикла (приблизительно 90% клеток находились в состоянии фазыG0/G1). Как показано с помощью FACS, дополнительные 32 часа сывороточного голодания в контрольной популяции, обработанной солевым раствором, не индуцировали апоптоз в MG63 клетках, а клетки, обработанные ПТГ в течение 32 часов, не были стимулированы к повторному вступлению в клеточный цикл из стадии покоя.

Результаты, характеризующие идентификацию белков и их поведение как следствие взаимодействия с ПТГ в течение 4, 8 и 32 часов, представлены в таблице 1. В совокупности с данными по окрашиванию клеток (автоматическое сканирование и компьютерно-целевой анализ имиджей гелей в программе PDQest), они свидетельствуют о следующем.

ПТГ стимулирует выживание находящихся в стадии покоя (лишенных питания) остеобластов. Их отмирание, ассоциированное с фактором транскрипции 1, снижается в 4 раза после обработки ПТГ по сравнению с контролем. 

Наряду с качественным полиморфизмом, были обнаружены количественные изменения (на основе данных денситометрии), которые для ряда белковых компонентов являлись весьма существенными. Всего идентифицировано 15 белков, количество которых претерпевает изменение при действии ПТГ на остеобласты, причем каждое удлинение времени влияния ПТГ на остеобласты приводит к обнаружению новых белков, содержание которых увеличивается или уменьшается по сравнению с контролем.

Эти данные дополняют ранее опубликованные сведения по исследованию протеома остеобластов из костного мозга мышей [6, 7]. Таким образом, продемонстрировано, что методика является эффективным инструментом для мониторинга изменений белка клеток «ниши» ГСК в ответ на гормональную стимуляцию и, вероятно, другие внешние воздействия.

Таблица 1. Идентифицированные с помощью протеомики белки остеобластов, количество которых изменяется после взаимодействия клеток с ПТГ в течение разных периодов времени

ОБСУЖДЕНИЕ

Стволовость – ключевое свойство всех ГСК. Так принято называть их способность к самообновлению и возможность создавать дифференцирующееся потомство. Какие факторы управляют этой способностью? Одна из гипотез, отвечающих на этот вопрос, указывает на роль микроокружения ГСК, получившего название ниши ГСК [8, 9, 10]. В этой связи в нашей работе использованы остеобласты, являющиеся важными компонентами ниши. Остеобласты относительно просто готовятся для исследовательских целей и могут послужить материалом для создания протокола протеомного анализа. Остеобласты дают возможность изучения стимулирования клеток за счет внешних факторов, а опыты с ними являются переходным этапом к исследованию факторов, регулирующих ГСК, в том числе к пониманию природы их естественного состояния.

Например, можно полагать, что Jagged1 (Jag1), выделяемый остеобластами в ответ на обработку ПТГ, влияет на ГСК по сигнальному пути через рецептор Notch-1 [1, 8].

Поиск факторов, которые способствуют размножению ГСК в культуре, проводился и с использованием иммобилизованного Jag1 [11]. При этом Jag1-шарики имитировали действие остеобластов в нише ГСК. Определив нишу как детерминанту в регуляции ГСК, роль внутренних сигналов представляется с новой точки зрения - не только как регулирующих сами по себе, но и во взаимодействии с другими инструментами (например, цитокинами) для коллективного влияния ниши на функционирование ГСК.

Предполагаемые эффекты шариков с Jag1 и их аналогов in vivo в форме остеобластов на ГСК являются той стартовой точкой, исходя из которой, именно протеомика дает возможность исследовать роль остеобластов в пролиферации ГСК.

В литературе имеются сообщения о прямом влиянии остеобласт-подобных клеточных линий на гематопоэз in vitro. Ряд авторов полагает, что клеточные линии остеосаркомы не поддерживают прогениторную активность in vitro, как и  первичных (ранних) стволовых клеток [12, 13]. Предполагается, что клеточные линии остеосаркомы человека не способны поддерживать выживание CD34+ клеток костного мозга из-за высокого содержания трансформирующего фактора роста, производимого клетками этих линий [14]. При использовании клеточной линии CAL72 остеосаркомы показано, что ограниченное размножение гематопоэтических прогениторных клеток, вполне возможно [15]. Однако в этих опытах были использованы CD34+ клетки из пуповинной крови, что затрудняет интерпретацию поведения остеобластов по отношению к клеткам костного мозга [15].

Кроме частных результатов, нами достигнута оптимизация использования доступных технологий, комбинирование которых позволило получить улучшенные результаты протеомного анализа. Главной особенностью предлагаемого методического подхода  является трехступенчатая процедура фракционирования биологического материала, ведущая к повышению эффективности разделения белков методом двумерного гель-электрофореза на полиакриламиде.

Таким образом, мы акцентируем внимание на важности подготовки образца (клеточного содержимого), включая ультразвуковое разрушение мембран и разделение субклеточных частиц, позволяющее в дальнейшем проводить анализ белков, присутствующих в низких концентрациях.  В частности, дифференциальное экстрагирование белков осуществляется с помощью коммерчески доступного набора реагентов ProteoExtract® Subcellular Proteome Extraction Kit (S-PEK, Calbiochem, Germany). Этот набор содержит экстракционные буферные растворы, приготовленные с использованием соединений высокой чистоты, смесь протеаз и нуклеазу, устраняющую нуклеиновые кислоты.  Одним из преимуществ S-PEK является возможность избирательного и мягкого экстрагирования компонентов субклеточных структур специальными смесями реагентов. Благодаря этому, целый протеом превращается в субпротеомы меньшей сложности в отношении своего состава. Поэтапное применение трех буферных смесей позволяет последовательно выделить три фракции белков с растворимостью, изменяющейся от максимальной к минимальной.  На следующей стадии работы применяется набор реагентов 2D Clean-Up Kit (Amersham Biosciences), завершающий и оптимизирующий подготовку образцов к двумерному гель-электрофорезу (2D-PAGE). Эти реагенты количественно осаждают белки, оставляя помехообразующие соединения в растворенном состоянии.

В заключение согласимся с точкой зрения, что способность ПТГ стимулировать пролиферацию ранних кроветворных предшественников, вероятно, можно использовать для экспансии ГСК [16]. Таким образом, нами сделан очередной шаг к изучению возможности воздействия на кроветворные «ниши» или на молекулы сигнальных путей взаимодействия ГСК с микроокружением для стимуляции их роста.

Работа поддержана Министерством образования и науки Российской Федерации.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Zhu J., Emerson S. G. A new bone to pick: osteoblasts and the haematopoietic stem-cell niche. // Bioessays. – 2004. - Vol. 26. – Р. 595-599.

2. Calvi L. M., Adams G. B., Weibrecht K. W. et al. Osteoblastic cells regulate the hematopoietic stem cell niche. // Nature. – 2003. - Vol. 425(6960). – Р. 841-846.

3. Calvi L. M. Osteoblastic activation in the hematopoietic stem cell niche. // Ann.N.Y.Acad.Sci. – 2006. - Vol. 1068. – Р. 477-488.

4. Corral D. A., M. Amling., Priemel M. et al. Dissociation between bone resorption and bone formation in osteopenic transgenic mice. // Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. - 1998. – Vol. 95. – P. 13835-13840.

5. Weber J.M., Forsythe S.R., Christianson C.A. et al.  Parathyroid hormone stimulates expression of the Notch ligand Jagged1 in osteoblastic cells. // Bone. – 2006. – Vol. 355(12). - P. 55-66.

6. Kim S. H., Jun S., Jang H. S. & Lim S. K. Identification of parathyroid hormone-regulated proteins in mouse bone marrow cells by proteomics. // Biochem Biophys Res Commun. - 2005. – Vol. 330. – P. 423-432.

7. Свинарева Д.А., Нифонтова И.Н., Чертков И.Л., Дризс Н.И. Изменение хоуминга кроветворных клеток-предшественников после длительного воздействия паратиреоидного гормона. // Бюлл экспер биол мед. - 2006. – T. 142. – C. 97-101.

8. Zhang J., Niu C. Identification of the haematopoetic stem cell niche and control of the niche size. // Nature. - 2003. – Vol. 425(6960). – P. 836-841.

9. Arai F., Hirao A. Tie2/angiopoietin-1 signaling regulates hematopoietic stem cell quiescence in the bone marrow niche. // Cell.- 2004. – Vol. 118(2). – P. 149-161.

10. Taichman R. S. Blood and bone: two tissues whose fates are intertwined to create the hematopoietic stem-cell niche. // Blood. – 2005. – Vol. 105(7). – P. 2631-2639.

11. Vas V., Szilagyi L., Paloczi K. & Uher F. Soluble Jagged-1 is able to inhibit the function of its multivalent form to induce hematopoietic stem cell self-renewal in a surrogate in vitro assay. // J Leukoc Biol. – 2004. – Vol. 75. – P. 714-719.

12. Benayahu D., Horowitz M., Zipori D. & Wientroub S. Hemopoietic functions of marrow-derived osteogenic cells. // Calcif Tissue Int. – 1992. – Vol.  51. – P. 195-201.

13. Benayahu D., Gurevitch O., Zipori D. & Wientroub S. Bone formation by marrow osteogenic cells (MBA-15) is not accompanied by osteoclastogenesis and generation of hematopoietic supportive microenvironment. // J Bone Miner Res. – 1994. – Vol. 9. - P. 1107-1115.

14. Taichman R. S., Reilly M. J. & Emerson S. G. Human osteosarcomas inhibit hematopoietic colony formation: partial reversal by antibody to transforming growth factor-beta 1. // Bone. – 1997. – Vol. 21. – P. 353-359.

15. Rochet N. CAL72: a human osteosarcoma cell line with unique effects on hematopoietic cells. // Eur J Haematol. – 2003. – Vol. 70. – P. 43-51.

16. Петрова Т.В., Свинарева Д.А., Нифонтова И.Н. и др. Стромальная регуляция стволовых кроветворных клеток в длительных культурах костного мозга человека под действием паратиреоидного гормона. // Клеточные технологии в биологии и медицине. -  2006. - № 4. – С. 218-222.