ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» Росздрава

 

Эта статья была опубликована в  сборнике научных трудов "Естествознание и гуманизм" с материалами Шестой Международной Телеконференции (24-29 октября 2011 года). Информационная страница сборника. 

Проблема ишемических повреждений различных органов и тканей остаётся одной из самых актуальных и недостаточно изученных в медицине и биологии. Эта актуальность обусловлена в первую очередь запросами клинической медицины, где врачам приходится сталкиваться с ишемическим повреждением  различных органов [1, 2, 3, 15]. Несмотря на кажущуюся хорошую изученность последствий гипоксии для многих органов и тканей, в целом, механизмы ишемических повреждений разнообразных клеток и возможность их последующей регенерации остаются не до конца исследованными [2,11]. В рамках этой проблемы несомненный интерес представляют вопросы, связанные с воздействием ишемии на поджелудочную железу [4,6,7,13]. Этот интерес связан не только с конкретными клиническими ситуациями (тромбоз, эмболия, спазм сосудов поджелудочной железы), но и определяется малой изученностью последствий ишемии для данного органа, в частности, нет однозначных данных о времени развития структурных изменений в железе в зависимости от степени ишемии.  
Целью настоящей работы явилось экспериментальное изучение структуры поджелудочной железы на ранних сроках нарушения артериального кровообращения. Исследование поджелудочной железы проводилось на 38 кошках массой от 2,25 кг до 3,75 кг методами ЭПР- и  ЯМР-спектроскопии.  

Материалы и методы исследования
Изучали поджелудочную железу кошки на различных сроках ишемии органа. После внутримышечного введения рометара в дозе 0,2мл/кг срединной лапаротомией вскрывалась брюшная полость. В операционную рану выводили желудок, печень, выделяли и перевязывали чревную и краниальную брыжеечную артерию на различные сроки от 0 до 90 минут (сроки перевязки сосудов 5, 15, 30, 60, 90 минут). В качестве контроля были использованы 3 кошки, которым была произведена лапаротомия, а лигатуры на артерии, кровоснабжающие поджелудочную железу не накладывались. Поджелудочная железа нарезалась на кусочки, которые при ЭПР-спектроскопии подвергались замораживанию жидким азотом и стандартизировались с помощью пресс-формы. Спектры ЭПР регистрировались на ЭПР спектрометре SE/X-2544 фирмы «Радиопан» (Польша) с рабочей частотой 9400 мГц (Х-диапазон), шириной протяжки магнитного поля 2000 гаусс. Сигнал ЭПР записывался в виде первой производной линии максимального наклона в миллитеслах (мТ) поглощения. Полуширина линии измерялась между точками максимального наклона. Для сравнительной оценки спектров ЭПР был выбран g-фактор.
ЯМР-спектроскопия проводилась при  комнатной температуре на ЯМР-спектрометре MSL-400 фирмы «Брукер» (Германия), на частоте 161.9 мГц., магнитное поле 9,395 тесла. После экспериментальной ишемии поджелудочная железа извлекалась из брюшной полости, разрезалась на кусочки, которые стандартизировались по объему пробирки. Тотчас же проводилась ЯМР-спектроскопия. Нами исследованы  образцы поджелудочной железы в контроле, и далее через 5, 15, 30, 60, 90 минут ишемии. В ЯМР-спектрах тканей определялись  неорганический фосфор (+5ррm) и фосфокреатин (0ppm). С помощью ЯМР-спектроскопии получили спектры данных соединений в поджелудочной железе и проследили их динамику в зависимости от степени ишемии органа.
Полученные спектры идентифицировались в сравнении со спектрами, полученными  Felix Wehrli  и W. Semmler [14,17].
Исследование животных производили согласно международным и Российским  этическим нормам.

Результаты и обсуждение
Результаты ЭПР- и ЯМР- спектроскопии оценивали в условных единицах (1условная единица ═1мм). Статистическую обработку проводили по тестам Student. Различия между экспериментальными данными считали достоверными, если Р≥0,95. Результаты представлены как среднее значение ± среднее квадратичное отклонение.
С помощью ЭПР-спектроскопии  в нормальной поджелудочной железе удалось  определить сигналы с g-факторами 1,94, 1,92 и 1,89, исходящими от железосерных белков, а также сигнал с g-фактором 2,025, исходящим от окисленного центра сукцинат-коэнзимредуктазы.
ЭПР-спектроскопия уже через 5 минут ишемии выявляла увеличение интенсивности сигналов с g=1,94, g=1,92 и 1,89 и уменьшение сигнала с g=2,025. При увеличении продолжительности ишемии до 30 минут отмечался дальнейший рост интенсивности сигнала с g=1,94,g=1,92 , g=1,89 и снижение интенсивности сигнала с g=2,025. Через 60 минут ишемии интенсивность сигналов  g=1,94, g=1,92, g=1,89 значительно увеличивалась, а выраженность сигнала с g=2,025 снижалась, что и отражено в таблице. Полученные данные отражают негативные процессы, происходящие в митохондриальной дыхательной цепи.    

Таблица  

Результаты ЭПР-спектроскопии поджелудочной железы на разных сроках ишемии при температуре 77є К

 

Примечание:  *    - достоверные различия между интенсивностью сигналов от  паренхимы нормальной  и ишемизированной поджелудочной железы.  В скобках указано количество исследуемых животных.
                                                               
ЯМР-спектроскопия выявила в паренхиме нормальной поджелудочной железы интенсивный сигнал, исходящий от фосфокреатина и незначительный сигнал от неорганического фосфата.
Через 5 минут ишемии  определялось снижение, по сравнению с контролем, интенсивности сигнала от фосфокреатина и увеличение интенсивности сигнала от неорганического фосфата. Через 30 минут ишемии наблюдалось дальнейшее снижение интенсивности сигнала от фосфокреатина и увеличение интенсивности сигнала от неорганического фосфата, что свидетельствовало об ухудшении энергетического метаболизма.

Выводы   
1.ЭПР-спектроскопия позволяет выявить изменения в поджелудочной железе кошки уже через 5 минут после прекращения артериального кровотока, по мере развития ишемических повреждений  отмечается увеличение интенсивности сигналов от железосерных белков, а также снижение её от окисленного центра сукцинат-коэнзимредуктазы, что свидетельствует о негативных  сдвигах в митохондриальной дыхательной цепи.
2 ЯМР - спектроскопии выявляет изменения в поджелудочной железе кошки через 5 минут ишемии, На фоне продолжающейся ишемии отмечается снижение интенсивности сигнала от фосфокреатина и рост интенсивности сигнала от неорганического фосфата, что говорит об ухудшении энергетического метаболизма.    

Литература
1. Байкеев Р.Ф. Деструкция тканей и свертывание крови /Р.Ф. Байкеев. –Казань: РЕМАРК, 1994. – 217 с.
2. Биленко М.В. Ишемические и реперфузионные повреждения органов / М.В. Биленко. – М.: Медицина, 1989. – 368 с.
3. Богданов О.А. Морфологическая характеристика изменений скелетных мышц при острой ишемии конечностей и постишемической рециркуляции /О.А. Богданов, И.В. Булычева, Г.А. Чекарева //Патологическая анатомия циркуляторных расстройств и нарушений тканевого гомеостаза: сб. науч. тр. /под ред. Г. А. Чекаревой. – М., 1987. – С. 49–53.
4. Ефимов А.Л. Прогностические критерии тяжести острого панкреатита  в зависимости от изменения показателей микроциркуляции / А. Л. Ефимов; И. В. Гайворонский, С.В. Петров // Вестник Санкт-Петербургского университета. Серия 11, Медицина. - 2006. - Вып. 1. - С. 94 – 101.
5. Ингрэм Д. Электронный парамагнитный резонанс в биологии / Д. Ингрэм. – М. Мир, 1972 . – 296 с. 27.
6. Кокуева О.В., Усова О.А., Новоселя Н.В. Диагностика заболеваний поджелудочной железы: прошлое, настоящее и будущее / О.В. Кокуева, О.А. Усова, Н.В. Новоселя // Клиническая медицина. - 2001. – № 5. – С. 56-58.
7. Кубышкин В. А. Панкреонекроз: диагностика и лечение: автореф. дис... д-ра мед. наук. / В.А Кубышкин. - М., 1986. - 48 с.
8. Михайличенко В.Ю. Экспериментальная оптимизация оперативных приемов изъятия сегмента поджелудочной железы для трансплантации / В.Ю. Михайличенко // Торсуевские чтения: сб. науч.-практ. работ, -Днепропетровск,1999. – С. 147-149.
9. Рууге Э.К. Редокс - состояние переносчиков электрон – транспортной цепи митохондрий сердца в условиях перфузии – ишемии – реперфузии: исследование методом низкотемпературной ЭПР - спектроскопии / Э.К. Рууге, В.Л. Лакомкин, А.А. Тимошин // Биофизика, Т 42, № 6, - 1997. –С. 1240-1245.
10. Степанов А.А. ЯМР – спектроскопия высокого разрешения как метод исследования биологических жидкостей человека в норме и в патологии / А.А. Степанов, В.П. Кутышенко, В.С. Христофоров // Материалы Пущинской конференции молодых ученых. – Пущино, - 2008. – С. 57-58.   
11.Тимошин А.А. Влияние ишемического прекондиционирования на свободнорадикальные центры изолированного сердца крысы при  ишемии и на ранней стадии реперфузии / А.А. Тимошин, В.Л.  Лакомкин, Э.К. Рууге // Биофизика, – 2000. – Т 45, - № 1, – С.112 -118.
12.Тимошин А.А.Динитрозильные комплексы железа-–новый тип гипотензивных препаратов / А.А. Тимошин, И.Р. Орлова, Э.К.Рууге и др.// Биофизика. – 2005. –Т 50, -№3, -С.537-543.
13. Ahmed S. Acute pancreatitis during sickle cell vaso-occlusive painful crisis / Ahmed S., Siddiqui A.K., Siddiqui R.K. et al // Am J Hematol. – 2003. – Jul, 73 (3). - p. 190-193.
14. Felix  W.  Biomedical magnetic resonance imaging / W. Felix, D. Shaw, J. Bruce. - Kneeland VCH Publishers Jnc., 1988. - 601 p.
15. Drummond A. Development of a system for simultaneous 31P NMR and optical transmembrane potential measurement in rabbit hearts / A. Drummond, J. Macdonald, J. Dumas, et al. // Eng Med Biol Soc. - 2004. - 3. - р.2102 -2104.
16. Duchen MR. Imaging mitochondrial function in intact cells. // MR. Duchen, A. Surin, J. Jacobson, // Methods Enzymol – 2003. - 361: p. 353–389.
17. Semmler W. In vivo magnetic resonance spectroscopy: basic principles and clinical applications in oncology / Deutsches Krebsforschungszentrum Heidelberg, 2005. - p. 157-171.