Научно-исследовательский институт атеросклероза (Сколково), Москва
Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии РАМН, Москва
Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова, Москва

 

 

Эта статья была опубликована в  сборнике научных трудов "Естествознание и гуманизм" с материалами Шестой Международной Телеконференции (24-29 октября 2011 года). Информационная страница сборника.

Введение.
Одним из первых проявлений атеросклероза на клеточном уровне является накопление липидов, в частности эфиров холестерина,  в интиме артерий [1-3]. Источником липидов, накапливающихся в интиме сосудов являются циркулирующие в крови липопротеиды низкой плотности (ЛНП) [4-5]. При этом нативные ЛНП, циркулирующие в крови не способны вызывать накопление липидов в культивируемых клетках, то есть не атерогенны [6-8]. С другой стороны, многими исследователями было продемонстрировано, что модифицированные различным образом in vitro (ацетилированные, обработанные малоновым диальдегидом, вортексированные, гликозилированные и т.д.) ЛНП атерогенны [8-11].
Ранее было продемонстрировано, что модифицированные любым способом ЛНП образуют ассоциаты, и эти ассоциаты проявляют атерогенные свойства, вызывая накопление внутриклеточных липидов. Была выявлена прямая зависимость между размером ассоциатов ЛНП и их способностью вызывать накопление липидов в клетках, причем нативные ЛНП не образовывали ассоциатов и не обладали атерогенными свойствами, т.е. не вызывали  накопление внутриклеточных липидов [12].  Можно сделать предположение, что без модификации ЛНП невозможна их ассоциация, без ассоциации ЛНП не проявляются их атерогенные свойства. Исходя из этого, особый интерес представляет поиск модуляторов процесса ассоциации ЛНП.
Известно несколько эндогенных ингибиторов ассоциации ЛНП [10,13], такие как липопротеид-дефицитная сыворотка, бычий сывороточный альбумин (БСА),  липопротеиды высокой плотности (ЛВП) здоровых доноров и основной аполипопротеид ЛВП - ароА-I. Все они обладают амфифильными свойствами и, по-видимому, взаимодействуя  с гидрофобными участками на поверхности ЛНП, предотвращают взаимодействие частиц ЛНП между собой и, тем самым, ингибируют ассоциацию. Мало известно об экзогенных ингибиторах ассоциации. Между тем, поиск и изучение нетоксичных и биодоступных ингибиторов ассоциации ЛНП представляет большой практический интерес, если рассматривать подавление ассоциации ЛНП в качестве терапевтического подхода. Мы предположили, что на эту роль могут претендовать амфифильные сополимеры окиси пропилена (ОП) и окиси этилена (ОЭ), так называемые плюроники. В данной работе изучена способность различных плюроников влиять на ассоциацию ЛНП.

Материалы и методы.
В работе использованы плюроники®  P85 и L61 (BASF (Wyandotte, MI)).
Общую фракцию ЛНП выделяли двухстадийным ультрацентрифугированием в градиенте плотности NaBr из сыворотки больных сердечно-сосудистыми заболеваниями (мужчины в возрасте 40-74 лет с ранним бессимптомным атеросклерозом сонных артерий.) [14]. Концентрация белка в образцах ЛНП определялась с помощью метода Лоури.
Для изучения ассоциации ЛНП суспензию предварительно освобождали от имеющихся в ней спонтанно образующихся ассоциатов путем фильтрования через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм (Nalgene, США). Затем ЛНП в концентрации 0,5 мг белка/мл инкубировали при 37°С в изотоническом фосфатном буфере (ИФБ; GIBCO, Paisley, Великобритания; KCl 0,2 г/л, KH2PO4  0,2 г/л, NaCl 8 г/л, Na2HPO4 1,15 г/л, рН 7,2) при постоянном перемешивании – 100 оборотов в минуту.  Степень ассоциации ЛНП оценивали методом регистрации флуктуации светопропускания луча лазерного света длинной волны 860 нм при помощи прибора Агрегометр (Aggregation analyzer, Biola, RF) [15]. Метод основан на том, что относительная дисперсия колебаний оптической плотности, вызванных случайными изменениями в количестве частиц, попадающих в оптический путь лазерного луча, отражает отклонения от их среднего размера, то есть степень их ассоциации. Через определенные промежутки времени регистрировали флуктуацию светопропускания.
Средний размер образовавшихся ассоциатов оценивали методом квазиупругого лазерного рассеивания на приборе Аутосайзер 2-Малверн (Autosizer 2-Malvern, Malvern Instruments, UK). Для этого образцы ЛНП с концентрацией 2,5 мг белка/мл инкубировали при 37°С в изотоническом фосфатном буфере при постоянном перемешивании – 1000 оборотов в минуту. Через определенные промежутки времени проводили измерение размера частиц.

Результаты.
Частицы ЛНП склонны к самопроизвольной ассоциации. В условиях инкубации суспензии частиц ЛНП при 37°С при постоянном перемешивании происходит так называемая спонтанная, не индуцированная внешними факторами ассоциация ЛНП. Для оценки ассоциации ЛНП и влияния плюроников на этот процесс мы использовали два метода – метод флуктуации светопропускания и метод квазиупругого лазерного рассеивания. Во всех случаях результаты, полученные при помощи двух методов оценки ассоциации ЛНП, полностью совпадали.
В данной работе мы провели сравнительное исследование действия плюроников с различными гидрофильно-липофильными свойствами на процесс ассоциации ЛНП. Так, нами были использованы плюроник L61, характеризующийся значительной гидрофобностью (ГЛБ 3), и плюроник Р85 с умеренными гидрофильными и липофильными свойствами (ГЛБ 16).
На рисунке 1 приведены типичные кинетические кривые изменения среднего размера частиц ЛНП в случае спонтанной ассоциации и в присутствии плюроника Р85. Видно, что при спонтанной ассоциации происходит увеличение среднего размера частиц в зависимости от времени инкубации (Рис. 1). В то же время при добавлении различных концентраций плюроника Р85 формирование ассоциатов заметно ингибировалось. Так, добавление  к суспензии ЛНП до начала инкубации плюроника Р85 в концентрации 0,1% (в/в %) ингибировало процесс ассоциации после 4,5 часов инкубации на 93% (Рис. 1). Эффект подавления зависел от концентрации плюроника, в концентрации Р85 0,01% наблюдалось подавление ассоциации после 4,5 часов инкубации на 79 % (Рис. 1).

 

Рисунок 1 Кинетические кривые изменения флуктуации светопропускания суспензии под влиянием плюроника Р85. Среда инкубации – ИФБ,  рН 7,4, концентрация ЛНП 0,5 мг белка/мл, температура инкубации 37°С, скорость перемешивания 100 об/мин. Кривая (1) – суспензия ЛНП в отсутствие плюроника Р85, кривые (2),(3) и (4)  в присутствии, соответственно, 0,005%

Аналогичные данные были получены методом флуктуации светопропускания. Как видно из рисунка 1, наименьшая концентрация плюроника Р85 – 0.005% не оказывала влияния на процесс ассоциации ЛНП. Таким образом, очевидно, что плюроник Р85 является ингибитором ассоциации ЛНП только в концентрации близкой или большей, чем критическая концентрация мицеллообразования (ККМ), которая составляет в  его случае 0,03%.
Когда плюроник Р85 добавлялся в суспензию ЛНП в ходе инкубации, то есть,  когда процесс ассоциации частиц уже был инициирован, и произошло увеличение среднего размера частиц ЛНП, также наблюдалась остановка дальнейшей ассоциации липопротеидов (Рис. 2). Плюроник Р85 в концентрации 0,1% добавлялся к суспензии ЛНП после первого и после второго часа инкубации, в обоих случаях не происходило дальнейшего увеличения среднего размера частиц, т.е. ассоциация полностью подавлялась. Необходимо отметить, что добавление плюроника не вызывало уменьшение среднего размера частиц, можно предположить, что под действием плюроника не происходило диссоциации образовавшихся ассоциатов ЛНП. Следовательно, ассоциация имеет необратимый характер, и является, скорее всего, слиянием частиц ЛНП.

 

Рисунок 2 Кинетические кривые изменения среднего размера частиц ЛНП под влиянием плюроника Р85. Среда инкубации – ИФБ,  рН 7,4, концентрация ЛНП 2,5 мг белка/мл, температура инкубации 37°С, скорость перемешивания 1000 об/мин. Кривая (1) – суспензия ЛНП в отсутствие плюроника Р85, кривая (2) – в присутсвии 0,1 % плюроника Р85, добавленного после 2 часов инкубации, кривая (3)  – в присутсвии 0,1 % плюроника Р85, добавленного после 1часа инкубации.

Помимо плюроника Р85, мы изучили способность обладающего выраженными гидрофобными свойствами и низким значением ГЛБ плюроника L61ингибировать ассоциацию ЛНП. Так, в концентрации 0,022% плюроник L61 ингибировал рост флуктуации светопропускания суспензии ЛНП после 2 часов инкубации на 78%. Использование большей концентрации плюроника L61 - 0,22% приводило к почти  полному подавлению процесса ассоциации ЛНП, а применение меньшей концентрации – 0,0022% не влияло на ассоциацию частиц ЛНП (данные не приводятся).
Таким образом, плюроники с выраженными гидрофобными свойствами P85 и L61 в концентрациях близких или больших ККМ ингибировали процесс ассоциации ЛНП.

Обсуждение.
Ассоциация частиц ЛНП может выражаться как в обратимой агрегации частиц, так и в необратимом слиянии модифицированных частиц ЛНП.  Механизмы ассоциации частиц ЛНП до сих пор полностью не ясны. Имеются данные, свидетельствующие о том, что при модификации ЛНП происходят изменения поверхностного гидрофильного слоя частицы, нарушения ее гидратно-сольватной оболочки, приводящие к повышению гидрофобности частицы и потере ее стабильности в растворе [10, 13]. На основании этого, предполагается, что ассоциация частиц ЛНП обусловлена гидрофобными взаимодействиями модифицированных частиц ЛНП.
 Мы изучили влияние плюроников на процесс ассоциаии ЛНП. Плюроники состоят из липофильной части, образованной окисью пропилена, и гидрофильной части, построенной окисью этилена, и имеют следующую структуру: (ОЭ)N-(ОП)M-(ОЭ)N. Такая структура определяет основные свойства плюроников, в том числе способность взаимодействовать с биологическими мембранами и вызывать в них структурные перестройки [16]. Важными характеристиками плюроников являются критическая концентрация мицеллообразования, при превышении которой происходит сборка отдельных сополимеров в мицеллы, а также гидрофильно-липофильный баланс (ГЛБ), отражающий соотношение гидрофильных и гидрофобных свойств вещества. В настоящее время существует большое количество плюроников, отличающихся количеством мономеров ОЭ и ОП, и соответственно характеризующихся разными  гидрофильными и липофильными свойствами, молекулярной массой и ККМ [17].  Так, полимеры, характеризующиеся значительным  количеством остатков ОП и небольшим ОЭ отличаются высокой липофильностью, относительно низкими ККМ и ГЛБ, например, плюроник L61. Напротив, плюроники в составе которых ОЭ преобладает гидрофильны и  характеризуются высокими значениями ККМ и ГЛБ – плюроник F68. Наконец, существует группа плюроников с промежуточными свойствами, например P85.
Мы исследовали способность плюроников P85, L61 и F68 с различными характеристиками ККМ и ГЛБ. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что способность амфифильных сополимеров окиси пропилена и окиси этилена  ингибировать ассоциацию ЛНП прямо зависит от выраженности гидрофобных свойств плюроника. Плюроники с выраженными и умеренными гидрофобными свойствами L61 и P85 способны значительно ингибировать ассоциацию ЛНП, но происходит это только в концентрации, близкой к критической концентрации мицеллообразования. Из этого можно сделать вывод о том, что именно мицеллярная форма плюроника способна вызывать ингибирование ассоциации частиц ЛНП, а унимеры плюроников ингибирующими свойствами не обладают. Эти данные подтверждают предположение, впервые выдвинутое Khoo и соавторами [10] о роли гидрофобных взаимодействий в процессе ассоциации ЛНП. Предположительно, в ходе инкубации при постоянном перемешивании происходят конформационные изменения структуры ЛНП, приводящие к экспозиции гидрофобных участков на поверхности частиц.  Далее начинает происходить взаимодействие гидрофобных участков разных частиц, приводящее к ассоциации ЛНП. В случае присутствия в суспензии ЛНП амфифильных веществ, липофильная  часть амфифильной молекулы может взаимодействовать  с гидрофобными доменами на поверхности частицы ЛНП экранировать их и, таким образом, предотвращать процесс ассоциации ЛНП.
Учитывая большое значение ассоциации ЛНП в патогенезе атеросклероза, полученные данные о возможности подавления ассоциации с помощью плюроников могут стимулировать разработку новых подходов к терапии и профилактике атеросклероза. Активно исследуется возможность применения плюроников в качестве переносчиков лекарственных средств, отличающихся низкой биодоступностью. Например, при лечении мультирезистентных опухолей [18] мицеллы плюроников с лекарством проявляют гораздо более высокую цитотоксичность по отношению к раковым клеткам, чем лекарство без добавления  плюроников. Плюроник P85 также используются при необходимости проникновения лекарств через гематоэнцефалический барьер [19].
Различные плюроники давно используются в качестве «носителя» лекарств, который способствует транспорту лекарств в неизменном виде. Но их роль гораздо более значительна. Были изучены механизмы действия плюроников на мультирезистентные клетки. Было показано, что они уменьшают микровязкость мембраны клетки,  значительно увеличивают уровень АТФ в раковых и соседних клетках, уменьшают эффлюкс лекарств и многое другое [20]. Кроме того, плюроники проявляют собственную разностороннюю биологическую активность, в том числе и способность влиять на обмен липидов. Так, при пероральном приеме плюроник L81 нарушал сборку и секрецию хиломикронов, способствовал снижению уровня холестерина ЛНП и липопротеидов очень низкой плотности (ЛОНП) и предотвращал развитие индуцированных диетой гиперхолестеринемии и атеросклероза у крыс [21]. С другой стороны плюроник P-407 вызывает гиперлипедемию у мышей [22].
Описанная в работе возможность модуляции ассоциации ЛНП различными плюрониками можно рассматривать как предпосылку к созданию лекарственного средства, которое будет влиять на развитие атеросклероза на самой начальной стадии – стадии накопления липидов в сосудистой стенке.
Работа поддержана Министерством образования и науки России

Литература:
1.    Аничков НН. Частная патологическая анатомия. Выпуск II. Сердце и сосуды. Второе издание. Москва-Ленинград, Медгиз, 1947.
2.    Smith EB. The relationship between plasma and tissue lipids in human atherosclerosis //Adv Lpid Res. 1974 – VOL. 12 -  P. 1-49.
3.    Mahley RW, Innerarity TL, Weisgraber KH, Oh SY. Altered metabolism (in vivo and in vitro) of plasma lipoproteins after selective modification of lysine residues of apoproteins // J Clin Invest. 1979 VOL. 64 – P. 743-750.
4.    Alaupovic P. Apoliproproteins and lipoproteins //Atherosclerosis, 1971 VOL. 13(2) – P. 141-6.
5.    Cookson FB. The origin of foam cells in atherosclerosis // Br J Exp Pathol, Feb 1971 - VOL. 52(1) – P. 62-9.
6.    Bates SR, Wissler RW. Effect of hyperlipemic serum on cholesterol accumulation in monkey aortic medial cells //
Biochim Biophys Acta, 1976 – VOL. 450(1) – P. 78-88.  
7.    Ross R., Harker L. Hyperlipidemia and atherosclerosis // Science, 1976 - VOL. 193 – P. 1094-1100.
8.    Goldstein JL, Ho YK, Basu SK, and Brown MS. Binding site on macrophages that mediates uptake and degradation of acetylated low density lipoprotein, producing massive cholesterol deposition // Proc Natl Acad Sci USA 1979 – VOL. 76 – P.  333–337.
9.    Fogelman AM, Shechter I, Seager J, Hokom M,  Child JS and Edwards PA. Malondialdehyde Alteration of Low Density Lipoproteins Leads to Cholesteryl Ester Accumulation in Human Monocyte-Macrophages // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980 – VOL. 77 – P. 2214 - 2218.
10.    Khoo JC, Miller E, McLoughlin P and Steinberg В. Prevention of low density lipoprotein aggregation by high density lipoprotein or apolipoprotein A-I. // J. Lipid Res., 1990 – VOL. 31 – P. 645.
11.    Lopes-Virella MF, Klein RL, Lyons TJ, Stevenson HC and Witztum JL. Glycosylation of low-density lipoprotein enhances cholesteryl ester synthesis in human monocyte-derived macrophages // Diabetes, 1988 – VOL. 37 – P. 550.
12.    Tertov VV, Sobenin IA, Gabbasov ZA, Popov EG, Orekhov AN. Lipoprotein aggregation as an essential condition of intracellular lipid caused by modified low density lipoproteins //  Biochem Biophys Res Commun 1989 – VOL. 16 – P. 489.
13.    Talbot RM, del Rio JD, Weinberg PD. Effect of fluid mechanical stresses and plasma constituents on aggregation of LDL // J. of Llipid Research, 2003 - Vol. 44 - P. 837
14.    Tertov V.V., Kaplun V.V., Orekhov A.A. Low-density lipoprotein modification occurring in human plasma possible mechanism of in vivo lipoprotein desialylation as a primary step of atherogenic modification // Atherosclerosis. 1998 - Vol. 138 - P. 183-195.
15.    Tertov V.V., Sobenin I.A., Gabbasov Z.A., Popov E.G., Jaakkola O., Solakivi T., Nikkari T., Smirnov V.A., Orekhov A.A. Multiple-modified desialylated low density lipoproteins that cause intracellular lipid accumulation. Isolation, fractionation and characterization // Laboratory Investigation. 1992 - Vol. 67 - P. 665-675.
16.    Vinogradov SV, Batrakova EV, Li S, Kabanov AV. Mixed polymer micelles of amphiphilic and cationic copolymers for delivery of antisense oligonucleotides // J. Drug Target 2004 - Vol. 12 - P.517.
17.    Batrakova EV, Li S, Alakhov VY, Miller DW, Kabanov AV. Optimal structure requirements for pluronic block copolymers in modifying P-glycoprotein drug efflux transporter activity in bovine brain microvessel endothelial cells // Farmacol. Exp. Ther. 2003 - Vol. 304 - P.845.
18.    Alakhova DY, Rapoport NY, Batrakova EV, Timoshin AA, Li S, Nicholls D, Alakhov VY, Kabanov AV. Differential metabolic responses to pluronic in MDR and non-MDR cells: a novel pathway for chemosensitization of drug resistant cancers //  J Control Release. 2010 – Vol. Feb 25;142(1) – P. 89-100.
19.    Batrakova EV, Li S, Li Y, Alakhov VY, Kabanov AV. Effect of pluronic P85 on ATPase activity of drug efflux transporters. // Pharm Res. 2004 – Vol. Dec;21(12) – P. 2226-33.
20.    Batrakova EV, Li S, Li Y, Alakhov VY, Elmquist WF, Kabanov AV. Distribution kinetics of a micelle-forming block copolymer Pluronic P85. // J Control Release. 2004 -  Vol. Dec 10;100(3)  - P. 389-97.
21.    Tertov V.V., Kaplun V.V., Orekhov A.A. // Atherosclerosis. 1998. - Vol. 138. - P. 183-195
22.    Johnston TP, Baker JC, Hall D, Jamal AS, Emeson EE, Palmer WK.Potential downregulation of HMG-CoA reductase following chronic administration of P-407 to C57BL/6 mice. // J Cardiovasc Pharmacol 1999 Vol. 34 – P. 831-842.