Эта работа опубликована в сборнике статей с материалами трудов 2-ой международной телеконференции "Проблемы и перспективы современной медицины, биологии и экологии". Название сборника "Фундаментальные науки и практика Том 1, №2"

Посмотреть обложку сборника

Скачать информацию о сборнике (в архиве: обложка, тит. лист, оглавление, список авторов)

Скачать сборник целиком или по частям можно ЗДЕСЬ

1 Научно-исследовательский институт атеросклероза Российской академии естественных наук (г. Москва),

2 Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии Российской академии медицинских наук (г. Москва),

3 Университетская клиника Эссена (г. Эссен, Германия).

Резюме

Было проведено клинико-лабораторное исследование, в котором оценивали возможную клиническую значимость внутриклеточного накопления холестерина, индуцированного сывороткой крови человека, в условиях клеточной тест-системы в отношении связи измеряемого показателя с основными факторами риска атеросклеротических заболеваний и прямыми количественными характеристиками степени развития атеросклероза. Была изучена динамика данных показателей у 406 человек в течение 5 лет наблюдения. Результаты исследования показывают, что индуцированное сывороткой крови накопление холестерина в условиях клеточного теста может являться новым биохимическим маркером атеросклеротического процесса, а также служить прогностическим признаком повышения уровня общего холестерина и холестерина липопротеидов низкой плотности. Показатели клеточного теста ассоциированы с наличием кальцинатов в коронарных артериях и накоплением коронарного кальция, а также с изменениями плече-лодыжечного индекса, что свидетельствует о связи этого маркера с прогрессированием атеросклероза.

 
Введение

Несмотря на прогресс, достигнутый в понимании атерогенеза, важным моментом для врачей и патофизиологов остаётся выявление и разработка новых эффективных и относительно простых методов диагностики атеросклероза и его прогрессирования. Без этого невозможно раннее выявление атеросклеротического поражения, прежде всего путём скрининга, оценка эффективности лечения, прогноз естественного течения атеросклероза. В настоящее время для этих целей применяются различные методы неинвазивной визуализации атеросклеротического поражения (ультразвуковое исследование, компьютерная томография), оценка факторов риска, включая маркеры активности течения атеросклероза, оценка риска тромботических осложнений и выявление генетического полиморфизма.
Показателем, отвечающим потребностям научного и врачебного сообществ, может служить определение способности сыворотки крови вызывать накопление внутриклеточного холестерина в условиях клеточной тест-системы [1]. Известно, что накопление холестерина в клетке с последующим формированием пенистых клеток- это ключевое звено в развитии атеросклероза. В настоящее время появилось некоторое понимание значения этого феномена, как в теоретическом, так и в практическом плане, однако необходимы дальнейшие исследования, в частности для определения его значимости в диагностике и прогнозе течения атеросклероза [2].
До настоящего времени не были известны долговременные параметры описанного феномена, что затрудняло его использование как маркера естественного течения атеросклероза. Имелось предположение, что развитие атеросклероза с возрастом сопровождается повышением способности сыворотки крови вызывать проатерогенные сдвиги на клеточном уровне. Для проверки этого предположения было выполнено открытое проспективное исследование, в котором динамика изменений проатерогенных свойств сыворотки крови была оценена на протяжении длительного периода наблюдения. Данное исследование проводилось в рамках международного сотрудничества в качестве подпрограммы научного исследования Heinz Nixdorf RECALL (Risk Factors, Evaluation of Coronary Calcium and Lifestyle) Study [3].
Материалы и методы

В исследование были включены данные, полученные при обследовании 406 человек, у которых исходно и через 5 лет наблюдения была оценена способность сыворотки крови вызывать накопление холестерина в условиях клеточной тест-системы. В качестве прямых количественных характеристик атеросклероза использовали измерение толщины интимо-медиального слоя сонных артерий с помощью дуплексного ультразвукового сканирования в режиме высокого разрешения, оценку коронарных кальцинатов методом электронно-лучевой компьютерной томографии, определение плече–лодыжечного индекса путем измерения систолического артериального давления на заднеберцовой и плечевой артериях под контролем допплерографии. Кроме того, определяли липидный профиль (уровень общего холестерина, альфа-холестерина, холестерина липопротеидов низкой плотности, триглицеридов), а также уровень С-реактивного белка.
Клеточный тест для определения способность вызывать накопление холестерина в культивируемых клетках был основан на первичной культуре моноцитов, полученных из крови здоровых доноров [4]. Накопление холестерина выражали в процентах по отношению к принятому за 100% содержанию холестерина в контрольных клетках, инкубированных без добавления исследуемой сыворотки крови. Достоверным накоплением холестерина считали уровень, более, чем на 17% превышающий контрольные значения; данную границу определили экспериментальным методом на основании вычисления трех стандартных отклонений по результатам серийных оценок положительных (вызывающих 1,3-1,6-кратное накопление холестерина) проб.
Анализировали 3 показателя: исходное значение, уровень, достигнутый после 5-летнего наблюдения и абсолютное изменение способности сыворотки крови вызывать накопление холестерина. Помимо оценки абсолютных показателей, данные оценивались также следующим образом: наличие данной способности в начале и по окончании наблюдения (биномиальная шкала); исчезновение, уменьшение, отсутствие изменений, увеличение (ординарная шкала); отсутствие данной способности в начале наблюдения и по его окончании или появление данной способности в процессе наблюдения (биномиальная шкала).
Для статистической оценки результатов использовали пакет статистических программ SPSS 14.0 (SPSS Inc., США). Учитывая ненормальное распределение изучаемых показателей, для обработки данных применяли непараметрические тесты [5]. Данные представляли в виде среднего значения, стандартной ошибки среднего и стандартного отклонения. Достоверными считали различия при 95% вероятности безошибочного прогноза.
     Результаты

Исходно средний показатель накопления холестерина в клеточном тесте атерогенности составил 125,4±1,9% (SD 38,5), через 5 лет наблюдения этот показатель повысился до 129,0±1.7% (SD 34,8), изменения были статистически достоверными (Z=-3,284, p=0,001).
Следовало учесть, что группа наблюдаемых лиц была неоднородной по исходной способности сыворотки крови вызывать накопление холестерина в клеточной тест-системе. Поэтому участники исследования были разделены на 2 группы: (1) лица, сыворотка крови которых не обладала проатерогенными свойствами (208 человек, или 51,2% выборки), и (2) лица, у которых сыворотка крови на момент включения в исследование вызывала достоверное накопление холестерина в культивируемых клетках (198 человек, 48,8% выборки). В первой группе исходное значение накопления холестерина составило 101,3±0,7% (SD 9,4), во второй – 150,8±2,9% (SD 41,1).     В первой группе наблюдаемых лиц через 5 лет было отмечено статистически достоверное повышение способности сыворотки крови вызывать накопление холестерина в культивируемых клетках до 117,0±1,8% (SD 25,5) (Z=-8,015, p<0,001). Во второй группе, напротив, способность сыворотки крови вызывать накопление холестерина в культивируемых клетках достоверно снизилась до 142,9±2,7% (SD 38,3) (Z=-2.944, p=0.003).     По окончании 5-летнего наблюдения доля лиц, у которых сыворотка крови была способна вызывать накопление внутриклеточного холестерина, возросла с 48,8% до 59,6%, при этом произошло перераспределение показателей. Из проб 1-й группы у 59,1% наблюдаемых лиц (123 из 208) сыворотка крови не приобрела атерогенных свойств, а у остальных 40,9% (85 из 208) сыворотка крови стала вызывать достоверное накопление холестерина в тест-системе. Во второй группе наблюдались следующие изменения: клеточный тест стал отрицательным у 20,7% участников (41 из 198), у 15,7% (31 из 198) способность сыворотки крови вызывать накопление холестерина достоверно уменьшилась, у 43,9% (87 из 198) осталась на прежнем уровне, и у остальных 19,7% (39 из 198) достоверно увеличилась.     В целом по всей группе наблюдаемых лиц был выявлен ряд связей с факторами риска сердечно-сосудистых заболеваний и прямыми количественными показателями атеросклероза. Исходные показатели клеточного теста коррелировали с уровнем общего холестерина (r=0,112; p=0,024), с уровнем С- реактивного белка через 5 лет наблюдения (r=0,142; p=0,015), с показателями клеточного теста через 5 лет наблюдения (r=0,449; p<0,001; n=406), а также имели тенденцию к корреляции с возрастом (r=0,092; p=0,065). Показатели клеточного теста, оцененные через 5 лет наблюдения отрицательно коррелировали с плече-лодыжечным индексом (r=-0,121; p=0,008).
В 1-й группе лиц (имевших отрицательные показатели клеточного теста при включении в исследование) показатели клеточного теста при включении в исследование не имели каких-либо достоверных связей с факторами риска или колическтвенными характеристиками атеросклероза.
В этой же группе лиц показатели клеточного теста по окончании 5-летнего наблюдения отрицательно коррелировали с исходным плече-лодыжечным индексом (r=-0,221; p=0,001) и положительно коррелировали с изменениями этого индекса за время наблюдения (r=0,150; p=0,037), положительно коррелировали с наличием коронарных кальцинатов при включении в исследование (r=0,238; p=0,031) и с изменениями количества коронарного кальция за время наблюдения (r=0,223; p=0,048).
При этом изменения абсолютных показателей клеточного теста отрицательно коррелировали с исходным плече-лодыжечным индексом (r=-0,201; p=0,004) и положительно коррелировали с изменениями этого показателя (r=0,165; p=0,021), положительно коррелировали с уровнем коронарного кальция после 5-летнего наблюдения (r=0,266; p=0,016).     Во 2-й группе лиц (имевших положительные показатели клеточного теста при включении в исследование) отмечалась тенденция к снижению плече-лодыжечного индекса за время наблюдения с 1,17±0,01 до 1,14±0,01 (Z=-1,832, p=0,067). В этой группе исходные показатели клеточного теста коррелировали с таковыми после 5-летнего наблюдения (r=0,477; p<0,001), с исходным значением толщины интимо-медиального слоя сонных артерий (r=0.146; p=0.046; n=186).
Показатели клеточного теста во 2-й группе по окончании 5-летнего наблюдения коррелировали с исходным уровнем липопротеидов низкой плотности (r=0,143; p=0,045), отрицательно коррелировали с уровнем С-реактивного белка после 5-летнего наблюдения (r=-0,193; p=0,021).     При этом изменения показателей клеточного теста во 2-й группе коррелировали с исходным уровнем липопротеидов низкой плотности (r=0,145; p=0,041; n=198); других значимых корреляций не было выявлено.

Обсуждение 
Результаты, полученные в проведенном исследовании, показывают, что индуцированное сывороткой крови накопление холестерина в условиях клеточного теста может являться новым биохимическим маркером атеросклеротического процесса, а также служить прогностическим признаком повышения уровня общего холестерина и холестерина липопротеидов низкой плотности. Показатели клеточного теста ассоциированы с наличием кальцинатов в коронарных артериях и накоплением коронарного кальция, а также с изменениями плече-лодыжечного индекса, что свидетельствует о связи этого маркера с прогрессированием атеросклероза.
Среди потенциальных биомаркеров деятельности атеросклероза, феномен индуцированного сывороткой крови накопления внутриклеточного холестерина может играть существенную роль, но его фундаментальная и клиническая значимость до сих пор не установлена. Хорошо известно, что отложение внутриклеточного холестерина с последующим образованием пенистых клеток является ключевым моментом в развитии атеросклероза [2]. К настоящему времени имеется ряд достижений, которые могут заложить хорошие теоретические и клинические основы для дальнейшего исследования феномена накопления холестерина в условиях клеточной тест-системы, особенно в отношении его диагностического и прогностического значения.
В настоящее время известно, что из сыворотки крови большинства больных с документированным коронарным атеросклерозом, в отличие от сывороток крови здоровых лиц, способны вызывать накопление липидов в культуре клеток [1,6]. Были разработаны соответствующие клеточные модели, основанные на первичных культурах человеческих клеток интимы аорты и моноцитах-макрфагах из крови человека, чтобы продемонстрировать это явление и охарактеризовать его как количественно, так и качественно [6,7]. Установлено, что показатели клеточного теста хорошо коррелируют со степенью атеросклероза коронарных артерий [1,6], и частота выявления положительных результатов теста повышена у лиц с субклиническим атеросклерозом и у больных с высоким сердечно-сосудистым риском (например, при сахарном диабете 2 типа, системной красной волчанке, выраженной гиперлипидемии) [8,9]. С другой стороны, в феномен накопления холестерина в условиях тест-системы выглядит как автономный фактор, независимый от традиционных факторов риска, таких как липиды сыворотки крови, артериальное давление, возраст и, возможно, половая принадлежность. Известно, что данный феномен в основном обусловлен наличием модифицированных липопротеидов низкой плотности [6,8], а также некоторых атерогенных факторов нелипидной природы [10,11].
Результаты теста на накопление внутриклеточного холестерина могут быть предложены в качестве интегральной характеристики первого этапа атерогенеза, моделируемого in vitro. Внутриклеточное накопление липидов является триггером последующих патологических изменений на клеточном уровне, таких, как усиление синтеза клеточного белка и компонентов соединительно-тканного матрикса, миграция клеток из крови в пораженную атеросклерозом ткань сосуда, клеточная пролиферации и, возможно, развитие местных воспалительных реакций [12].
Результаты недавнего 2-летнего проспективного исследования у мужчин с бессимптомным атеросклерозом показали, что имеется существенная связь между показателями клеточного теста и развитием атеросклероза. Повышение способности сыворотки крови вызывать накопление холестерина в условиях клеточной тест-системы ассоциировано с прогрессированием атеросклероза, а снижение или устранение этой способности ассоциировано с регрессией ранних атеросклеротических поражений [13].
Существуют и нерешенные вопросы. Так, недостаточно данных о возможности клинического использования показателей клеточного теста в качестве биомаркеров атеросклероза. Распространенность этого явления в широком диапазоне в эпидемиологических исследованиях до сих пор не изучена, хотя имеются ограниченные данные о возможном диагностическом значении показателя. Прогностическая значимость показателя клеточного теста была изучена на небольшой выборке, и была оценена только в отношении прогрессирования субклинического атеросклероза сонных артерий, но не клинических проявлений атеросклероза. Соотношение показателя клеточного теста с традиционными факторами риска, а также с показаниями прямой визуализации субклинического атеросклероза также требует масштабного изучения.
Таким образом, необходима более детальная оценка полученных результатов, а также проведение дальнейшего исследования связи показателей клеточного теста на прогрессирование атеросклероза и развитием его клинических проявлений.

Список литературы

1.    Chazov E.I., Tertov V.V., Orekhov A.N. et al. Atherogenicity of blood serum from patients with coronary heart disease. // Lancet 1986.-Vol.2.-pp.595-598.
2.    Orekhov A.N., Tertov V.V., Novikov I.D. et al. Lipids in cells of atherosclerotic and uninvolved human aorta. I. Lipid composition of aortic tissue and enzyme-isolated and cultured cells. // Exp. Mol. Pathol. 1985.-Vol.42.-pp.117-137.
3.    Schmermund A., Moehlenkamp S., Stang A. et al. Assessment of clinically silent atherosclerotic disease and established and novel risk factors for predicting myocardial infarction and cardiac death in healthy middle-aged subjects: Rationale and design of the Heinz Nixdorf RECALL Study. // Am. Heart J. 2002.-Vol.144.-pp.212-218.
4.    Tertov V.V., Orekhov A.N., Nikitina N.A. et al. Peritoneal macrophages: a model for detecting atherogenic potential in patients' blood serum. // Ann. Med. 1989.-Vol.21.-pp.455-459.
5.    Lang T.A., Secic M. How to report statistics in medicine: annotated guidelines for authors, editors, and reviewers. Second edition. American College of Physicians, Philadelphia, 2006, 490 P.
6.    Tertov V.V., Orekhov A.N., Martsenyuk O.N. et al. Low-density lipoproteins isolated from the blood of patients with coronary heart disease induce the accumulation of lipids in human aortic cells. // Exp. Mol. Pathol. 1989.-Vol.50.-pp.337-347.
7.    Orekhov A.N., Tertov V.V., Lyakishev A.A. et al. Use of cultured atherosclerotic cells for investigation of antiatherosclerotic effects of anipamil and other calcium antagonists. // J. Hum. Hypertens. 1991.-Vol.5.-pp.425-430.
8.    Sobenin I.A., Tertov V.V., Koschinsky T. et al. Modified low density lipoprotein from diabetic patients causes cholesterol accumulation in human intimal aortic cells. Atherosclerosis // 1993.-Vol.100.-pp.41-54.
9.    Kabakov A.E., Tertov V.V., Saenko V.A. et al. The atherogenic effect of lupus sera: systemic lupus erythematosus-derived immune complexes stimulate the accumulation of cholesterol in cultured smooth muscle cells from human aorta. // Clin. Immunol. Immunopathol. 1992.-Vol. 63.-pp.214-220.
10.    Orekhov A.N., Tertov V.V., Pokrovsky S.N. et al. Blood serum atherogenicity associated with coronary atherosclerosis. Evidence for nonlipid factor providing atherogenicity of low-density lipoproteins and an approach to its elimination. // Circ. Res. 1988.-Vol.62.-pp.421-429.
11.    Orekhov A.N., Tertov V.V., Kabakov A.E. et al. Autoantibodies against modified low density lipoprotein. Nonlipid factor of blood plasma that stimulates foam cell formation. Arterioscler. Thromb. // 1991.-Vol.11.-pp.316-326.
12.    Orekhov A.N., Tertov V.V., Kudryashov S.A. et al. Triggerlike stimulation of cholesterol accumulation and DNA and extracellular matrix synthesis induced by atherogenic serum or low density lipoprotein in cultured cells. // Circ. Res. 1990.-Vol.66.-pp.311-320.
13.    Sobenin I.A., Suprun I.V., Orekhov A.N. New insight into non-statin prevention and treatment of atherosclerosis. // In: Atherosclerosis: risk factors, diagnosis, and treatment. Eds. GM Kostner, KM Kostner. Monduzzi Editore, 2002, pp 305-308.