|
Ижевская государственная медицинская академия Эта работа опубликована в сборнике научных трудов «Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии» (2004 год, выпуск 1), под редакцией проф., д.м.н. Ильинских Н.Н. Посмотреть титульный лист сборника
Результаты исследования, проведенного с использованием люминесцентного метода выявления клеток, находящихся в процессе апоптоза (TUNEL), и иммуногистохимического мечения молекул МНС класса I, свидетельствуют о том, что периферическое введение бактериального ЛПС приводит к увеличению экспрессии молекул МНС I на субкапсулярных эпителиальных клетках и макрофагальных клетках кортико-медуллярной зоны тимуса, что сопровождается значительным усилением апоптоза тимоцитов в этих областях. На основе этих данных делается предположение о том, что в основе усиления ЛПС - индуцируемого апоптоза лежит увеличение авидности взаимодействия Т-клеток с антигенпрезентирующими клетками стромы тимуса за счет повышения экспрессии последними числа молекулярных комплексов пептид – МНС I.
Введение
Клональная делеция аутореактивных Т-лимфоцитов, достигаемая посредством их отрицательной селекции в тимусе, является основным механизмом, обеспечивающим толерантность иммунной системы к собственным антигенам. Интригующим представляется тот факт, что как отрицательная, так и положительная селекция созревающих лимфоцитов основаны на механизмах распознавания собственных пептидов, ассоциированных с молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС) на клетках стромы тимуса. Для объяснения этого феномена была предложена теория авидности, суть которой сводится к следующему. Авидность взаимодействия Т-клетки с презентированным антигенным пептидом зависит как от уровня экспрессии комплекса МНС-пептид на антигенпрезентирующей клетке, так и от аффинности и концентрации на поверхности Т-клеток антигенраспознающих рецепторов и корецепторных молекул. Тимоциты, которые свяжут комплекс пептид-МНС со средней по силе авидностью, получат сигнал на выживание и продолжат дифференцировку (положительная селекция), аутореактивные Т-лимфоциты, демонстрирующие высокую авидность к комплексу МНС-пептид на клетках кортико-медуллярной и мозговой зон тимуса погибают посредством апоптоза (отрицательная селекция) [1]. В результате большая часть созревающих в тимусе Т-клеток элиминируется. Известно, что введение бактериального липополисахарида (ЛПС) приводит к усилению процессов апоптоза в тимусе животных [2]. Мы предполагаем, что одним из механизмов, ответственным за этот эффект, может быть изменение авидности взаимодействия Т-клеток с антигенпрезентирующими клетками стромы тимуса за счет повышения экспрессии последними молекулярных комплексов пептид-МНС. Для проверки этого предположения изучались интенсивность экспрессии МНС I и число клеток, подвергшихся апоптозу, в тимусе крыс в норме и после интраперитонеального введения ЛПС.
Материал и методы
В эксперименте использовались 18 самцов белых беспородных крыс весом 200-250 г. Экспериментальным животным (9 крыс) интраперитонеально вводили 1 мл стерильного физиологического раствора, содержащего бактериальный липополисахарид (Sigma), в дозе 125 мкг/кг веса, контрольные животные получали инъекцию 1 мл стерильного физиологического раствора. Через 4 часа после введения эндотоксина крыс анестезировали и интракардиально перфузировали фиксатором Замбони. Для иммуногистохимического мечения криостатные срезы тимуса толщиной 14 мкм инкубировали в течение ночи при –4С в поликлоноклональных кроличьих антителах к МНС I (1:100, Рeninsula, USA). Вслед за этим проводили реакцию выявления первых антител вторыми антителами (1:100) меченными флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ) в течение 30 минут при температуре +37С. Часть стекол с криостатными срезами использовали для исследования локализации и интенсивности апоптоза тимоцитов. Об интенсивности апоптоза судили по количеству клеток с фрагментированной ДНК, выявляемой при помощи люминесцентного TUNEL-метода. Криостатные срезы инкубировали в реакционном растворе, содержащем терминальную дезоксинуклеотидилтрансферазу и меченые ФИТЦ нуклеотиды (Boehringer Mannheim), 60 мин при 37°С в темноте во влажной камере. Срезы изучали в люминесцентном микроскопе, с использованием 480±10 нм пропускающего и 520-550 нм запирающего фильтров для выявления свечения ФИТЦ. Подсчет клеток и измерение интенсивности люминесцентного свечения производили посредством компьютерного анализа видеоизображения с применением программы Image Pro (Medical Kibernetics, USA). Статистический анализ проводили с использованием t-критерия Стьюдента.
Результаты исследования и их обсуждение
Иммунопозитивные к молекулам МНС I клетки тимуса контрольной группы животных выявлялись, главным образом, на кортико-медуллярной границе, где преимущественно локализуются макрофаги и дендритные клетки. Немногочисленные светящиеся клетки отростчатой формы располагались в субкапсулярной зоне.
Таблица 1. Количество клеток, подвергшихся апоптозу, в тимусе крыс в условиях нормы и после введения бактериального липополисахарида. | | Субкапсулярная зона | Кортико-медуллярная граница | Мозговое вещество | | К | LPS | К | LPS | К | LPS | | Число клеток (% от контроля) | 100±4,2 | 381,7± ±2,4 ** | 100±3,2 | 356,2± ±3,8 ** | 100± ±1,6 | 404,3± ±4,0 ** | * Р < 0,05, ** P <0,01, К – контроль, LPS –введение липополисахарида Таблица 2. Интенсивность экспрессии МНС класса I в тимусе крыс в условиях нормы и после введения бактериального липополисахарида. | | Субкапсулярная зона | Кортико-медуллярная граница | Мозговое вещество | | К | LPS | К | LPS | К | LPS | | Число клеток (% от контроля) | 100±6,8 | 248,1±8,2 ** | 100±3,1 | 267,1±6,8 ** | _ | _ | | Интенсивность свечения (% от контроля) | 100±2,4 | 137,7± 3,2 * | 100±3,8 | 146,9± 4,0 * | _ | _ | * Р < 0,05, ** P <0,01, К – контроль, LPS –введение липополисахарида
Люминесцентная метка, выявляющая фрагментированные хромосомы, обнаруживалась в субкапсулярном слое в цитоплазме клеток, цитотопография и морфология которых позволяет предполагать их принадлежность к группе «клеток- нянек», метаболизирующих остатки погибших в результате апоптоза тимоцитов. Значительное количество тимоцитов, вступивших в апоптоз, располагалось на кортико-медуллярной границе, где происходят активные процессы отрицательной селекции. Апоптозный сигнал также обнаруживался в единичных тимоцитах коркового вещества и в непосредственной близости от сосудов мозгового вещества.
Через 4 часа после введения бактериального эндотоксина значительно возрастало количество клеток, иммунореактивных к молекулам МНС I, в субкапсулярной зоне и кортико-медуллярной области, а также повышалась интенсивность их свечения по сравнению с контрольными животными (табл.1). Рост экспрессии МНС I в этих зонах сопровождался увеличением числа тимоцитов, подвергшихся апоптозу (табл.2). Повышение числа клеток с люминесцентной меткой апоптоза (+304,3%; Р<0,01) наблюдалось также вблизи сосудов мозгового слоя.
Таким образом, сравнительный анализ полученных данных позволяет предполагать, что в случае антигенной стимуляции иммунной системы активируются быстрые внутритимусные механизмы программируемой гибели тимоцитов в областях, где происходит отрицательная селекция. Это может быть обусловлено ростом экспрессии молекул МНС класса I на клетках этих областей, соответствующим повышением авидности взаимодействия тимоцитов и тимусной стромы, что ведет к стимуляции процессов отрицательной селекции тимоцитов.
Список литературы
1. 1. Ashton-Rickardt P., Bandeira A., Delaney J., Van Kaer L., Pircher H.P., Zinkernagel R.M., Tonegawa S. Evidence for a differential avidity model of T cell selection in the thymus. // Cell. – 1994. – V.76 (4). – P.651-663.
2. Zhang Y.H., Takahashi K., Jiang G.Z., Kawai M., Fukada M.X.M., Yokochi T. In vivo induction of apoptosis (programmed cell death) in mouse thymus by administration of lipopolysaccharide.// Infect. Immun. – 1993. – V.61(12). – P.5044-5048.
|
