|
Пензенский государственный педагогический университет им. В.Г. Белинского Эта работа опубликована в сборнике научных трудов «Естествознание и гуманизм» (2005 год, Том 2, выпуск 5), под редакцией проф., д.б.н. Ильинских Н.Н. Посмотреть титульный лист сборника
Для выяснения роли и функции различных нейропептидов, а также ферментов их обмена широко применяются различные фармакологические препараты, которые часто вводятся внутрибрюшинно. При этом, как правило, ставится контроль – введение соответствующего количества физиологического раствора. При проведении острых экспериментов необходимо рассматривать все наблюдаемые явления с учетом изменений, вызванных внутрибрюшинной инъекцией, являющейся, по-видимому, стрессом для животных [1]. Ответная реакция организма может изменяться в зависимости от физиологического состояния организма. Одной из физиологических особенностей женского организма является наличие полового цикла, в ходе которого наблюдаются значительные изменения в функционировании пептидэргических систем, что, несомненно, связано с изменением активности ферментов, участвующих в обмене регуляторных пептидов [2]. К таким ферментам относится, в частности, карбоксипептидаза Н (КПН), катализирующая отщепление остатков аргинина и лизина с С-конца пептидов. Интерес к этому ферменту вызван тем, что он участвуют на заключительных этапах процессинга, в модуляции и инактивации биологически активных пептидов [3].
Опыты проводили на самках белых беспородных крыс массой 150-200 г. У крыс определяли стадию эстрального цикла по влагалищному мазку, при цитологическом исследовании которого животных разделяли на три группы. Самки первой группы находились в стадии диэструса, второй – в стадии проэструса, третьей – в стадии эструса. Каждую группу разбивали на две подгруппы: первая – интактная, животным второй подгруппы внутрибрюшинно вводили физиологический раствор в дозе 20 мл на 1 кг массы тела. Животных декапитировали через 0,5 часа, 4 часа и 18 часов после инъекции (декапитацию самок крыс в стадии проэструса проводили только через 0,5 часа и 4 часа после инъекции, так как продолжительность данной стадии эстрального цикла около 12 часов). Затем извлекали гипофиз, гипоталамус и яичники.
Активность КПН определяли при рН 5,6 по отщеплению дансил-фен-ала от дансил-фен-ала-арг методом Fricker и Snyder [3] как разность прироста флюоресценции в пробах, не содержащих и содержащих гуанидинэтилмеркаптоянтарную кислоту, и выражали в нмоль продукта, образующегося за 1 минуту инкубации на 1 мг белка. Концентрацию белка в пробах определяли методом Lowry. Достоверность отличий между средними значениями определяли с использованием t-критерия Стьюдента.
Результаты исследований показали, что активность КПН зависит от стадии эстрального цикла во всех изученных органах (см. таблицу). Разные стадии полового цикла могут быть расположены по мере убывания активности фермента в ряд: проэструс-эструс-диэструс (отличия статистически достоверны). Активность КПН в гипоталамусе на стадии эструса выше, чем на стадии проэструса (р<0,05). В яичниках активность фермента на стадии проэструса достоверно выше, чем в диэструсе (р<0,05). Полученные данные позволяют предположить, что КПН вовлекается в циклические изменения уровня биологически активных пептидов в изученных органах в ходе полового цикла.
Таблица. Влияние инъекции физиологического раствора на активность КПН на разных стадиях эстрального цикла (нмоль продукта, образовавшегося за 1 мин. инкубации на 1 мг белка, М±m, n=5-8). | Орган | Воздействие | Время | Стадии | | Диэструс | Проэструс | Эструс | | Гипофиз | норма | - | 0,45±0,04 | 1,23±0,14 | 0,69±0,05 | | физраствор | 0,5 часа | 0,64±0,09 | 0,80±0,04* | 0,36±0,02*** | | 4 часа | 0,87±0,12 | 0,58±0,02*** | 0,40±0,06** | | 18 часов | 0,42±0,06 | - | 0,78±0,05 | | Гипоталамус | норма | - | 0,24±0,02 | 0,21±0,01 | 0,25±0,01 | | физраствор | 0,5 часа | 0,21±0,02 | 0,21±0,02 | 0,23±0,02 | | 4 часа | 0,17±0,01** | 0,17±0,02 | 0,23±0,01 | | 18 часов | 0,25±0,02 | - | 0,29±0,01 | | Яичники | норма | - | 0,03±0,02 | 0,09±0,03 | 0,04±0,03 | | физраствор | 0,5 часа | 0,03±0,01 | 0,06±0,01 | 0,05±0,01 | | 4 часа | 0,026±0,01 | 0,05±0,01 | 0,07±0,01 | | 18 часов | 0,03±0,003 | - | 0,08±0,01 | Примечание: достоверность отличий * - р < 0,05, ** - р < 0,01, *** - р < 0,001 относительно нормы.
Внутрибрюшинное введение физиологического раствора приводило к уменьшению активности КПН в гипофизе на стадиях проэструса и эструса через 0,5 и 4 часа. Активность фермента снижалась также в гипоталамусе на стадии диэструса через 4 часа после воздействия. Вероятно, стресс, вызванный инъекций физраствора, приводит к увеличению секреции АКТГ, β-эндорфина и других биологически активных пептидов [5], при этом наряду с ними из везикул в кровяное русло может поступать и сам фермент, что приводит к уменьшению его количества и снижению активности в исследованных органах. Снижение активности КПН в гипоталамусе может способствовать также увеличению количества выводимой из организма жидкости за счет уменьшения образования вазопрессина [6]. В яичниках введение физиологического раствора не влияло на активность КПН.
Сравнение активности КПН на разных стадиях эстрального цикла при введении физиологического раствора показало, что на стадии эструса в гипофизе через 0,5 часа после оказания воздействия активность фермента достоверно ниже по отношению к диэструсу и проэструсу. Через 4 часа после введения физраствора активность уменьшалась при переходе от диэструса к проэструсу и далее к эструсу. В гипофизе через 18 часов после инъекции активность КПН была достоверно выше в диэструсе по сравнению с эструсом.
В гипоталамусе на стадии эструса через 4 часа после внутрибрюшинного введения физиологического раствора активность КПН выше, чем в диэструсе и проэструсе, а через 18 часов в диэструсе ниже, чем в эструсе.
В яичниках на стадии проэструса активность КПН достоверно выше, чем на стадии эструса, а через 4 и 18 часов в диэструсе активность ниже по сравнению с эструсом.
Таким образом, введение физиологического раствора может приводить к значительным изменениям в функционировании пептидергических систем, поэтому необходимо учитывать, что все наблюдаемые изменения, как минимум в течение 18 часов, происходят на фоне изменений, вызванных внутрибрюшинной инъекцией, а характер этих изменений во многом определяется стадией эстрального цикла, в которой находится животное. Кроме того, введение физраствора приводит к изменению соотношения активности фермента в исследуемых отделах в ходе эстрального цикла и ведет, в свою очередь, к изменению соотношения нейропептидов, что, вероятно, отражает один из механизмов нарушения функционирования половой системы при стрессе. 1. Вернигора А.Н., Никишин Н.Н., Генгин М.Т. Влияние внутрибрюшинного введения физиологического раствора на поведение крыс в тесте “открытое поле” и активность ферментов обмена нейропептидов // Физиол. журн. – 1995. – Т. 81, № 12. – С. 121-125.
2. Бабичев В.Н. Нейро-гуморальная регуляция овариального цикла. – М.: Медицина, 1984. – 240 с.
3. Fricker L.D., Snyder S.H. Purification and characterization of enkephalin convertase, an enkephaline-synthesizing carboxypeptidase // J. Biol. Chem.–1983.–V. 258, № 18.-P. 10950-10955.
5. Слепушкин В.Д., Лишманов Ю.Б., Золоев Г.К., Прум И.А. Современные представления о некоторых нетрадиционных механизмах стресса // Усп. физиол. наук. – 1985. – 16, № 4. – С. 106 – 118.
6. Нейрохимия / Под ред. Ашмарина И.П., Стукалова П.В. – М.: Изд-во Института биомед. химии РАМН, 1996. – 470 с.
|
