Авторы: Медведев В.С., Зайцева Н.С, Троицкий А.В., Лузгина Н.Г., Шкурупий В.А.

Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН (г. Новосибирск)

Эта статья опубликована сборнике научных трудов "Фундаментальные науки и практика" с материалами Третьей Международной Телеконференции "Проблемы и перспективы современной медицины, биологии и экологии" - Том 1 - №4. - Томск - 2010.

Окисленные декстраны представляют собой его производные, полученные в результате химического или радиационного окисления, содержащие карбонильные группы [1,2,3]. Установлено, что окисленные декстраны обладают высокой биосовместимостью  и могут быть использованы в качестве перспективной матрицы для иммобилизации биологически активных веществ, в том числе,  известных фармацевтических субстанций,  с целью, в том числе, обеспечения их адресной доставки в различные клетки-мишени [4,5,6].  В этой связи актуально обеспечение визуализации окисленных декстранов в клетках различного гистогенеза. Есть основания полагать, что наиболее перспективным подходом в этой связи является присоединении к окисленным полисахаридам флуоресцентной метки. Известны способы присоединения таких меток к немодифицированнм полисахаридам. Так, имеются коммерческие диагностические наборы для исследования эндоцитоза клеток различного гистогенеза (чаще – FITC меченные немодифицированные декстраны различной молекулярной массы), установлена их низкая цитотоксичность [7,8,9]. Вместе с тем, способы получения конъюгатов окисленных полисахаридов с флуоресцирующими веществами, обеспечивающими сохранность карбонильных групп (результат окисления), определяющих особые биологические свойства модифицированных окислением полисахаридов, практически не разработаны. 
Целью работы было: разработка метода получения флуоресцентных производных окисленных декстранов различной молекулярной массы со стандартизованным содержанием флуоресцеина; исследование перспектив их использования для внутриклеточной визуализации окисленных декстранов и их конъюгатов с биологически активными веществами.

Материалы и методы.
Окисленные полисахариды получали перманганатным методом (патент №011718, ЕПВ, «Способ получения диальдегиддекстрана», 28.04.2009). Флуоресцентные производные окисленных декстранов получали по разработанному авторами методу путем конъюгации окисленных декстранов с флуоресцеином с использованием карбонилдиимидазола  (заявка на изобретение РФ №2010116514).
Перитонеальные макрофаги получали промыванием брюшной полости мыши  средой RPMI-1640 с 1% FBS  и отмывкой от не прилипающей фракции клеток через 2 часа после начала культивирования. Инкубацию с мечеными флуоресцеином декстранами проводили в течение суток, затем клетки отмывали PBS, фиксировали 4% формалином в течение 15 минут, после отмывки ядра контрастировали DAPI. Эффективность захвата и качественное распределение меченых полисахаридов оценивали при помощи  флуоресцентной микроскопии на микроскопе AxioObserver D.1.
 Было установлено, что  конъюгация окисленных декстранов с флуоресцеином по предложенному авторами методу, позволяет сохранить стандартное содержание карбонильных  групп в составе конъюгата.
 На рисунке показан захват окисленного меченого флуоресцеином декстрана перитонеальным макрофагом, который визуализируется в цитоплазме клетки в виде в виде светящихся  гранул.
 

Рис. Захват окисленного декстрана, меченного флуоресцеином,  перитонеальным макрофагом мыши (стрелками показаны пинолизосомы с меченым полисахаридом)

Таким образом, разработан эффективный способ введения флуоресцентной метки в предварительно окисленные декстраны. Разработанный способ получения меченных флуоресцеином полисахаридов позволяет обеспечить  визуализацию его захвата  эндоцитирующими клетками методом флуоресцентной микроскопии, что позволяет  точно и наглядно определять механизмы транспорта вещества, а так же его качественного распределения  в цитоплазме клеток.

Список литературы:
1. Шкурупий В.А.., Потапова О.В., Лузгина Н.Г., Троицкий А.В. Пат. №011718 Евразийский, Шкурупий В.А.., Потапова О.В., Лузгина Н.Г., Троицкий А.В. Пат. №011717 Евразийский
2.   Prigent-Richard S., Cansell M., Vassy J., Viron A., Puvion E., Jozefonvicz J., Letourneur D.. - Fluorescent and radiolabeling of polysaccharides: Binding and internalization experiments on vascular cells. - J Biomed Mater Res, 1998, 40, 275–281.
3.   E. V. Novikova, E. V. Tishchenko, A. A. Iozep, and B. V. Passet. - Influence of Synthesis and Isolation Conditions on Properties of Dextran Polyaldehyde. – Rus. J. of App. Chem., Vol. 75, No. 6, 2002, pp. 985-988
4.   Shimizu N, Kawazoe Y. – A new method for permeabilization of the plasma membrane of cultured mammalian cells. III. Internalization of fluorescent dextrans into cultured mammalian cells by vortex-stirring in the presence of high molecular weight polyacrylic acid. – Biol Pharm Bull. 1996 Aug;19(8):1023-5.
5.    Shkurupii V.A., Arkhipov S.A., Troitskii A.V.,  Luzgina N.G., Zaikovskaja M.V., Gulyaeva E.P., Bystrova T.N., Ufimtseva E.G., Il'in D.A., Akhramenko E.S.  In vitro effect of oxidizeg dextrans of peritoneal cells // Bulletin of Experimental Biology and Medicine, Supplement 1.- 2008.- P.120-122.  
6.  Шкловчик О.В., Шкурупий В.А., Троицкий А.В. Терапевтическая эффективность и гепатотоксичность композиции изониазид-диальдегиддекстран, полученной методом радиационно-химического кисления декстрана // БЭБиМ, 2008. - Прил. 1.
7.  Schneck L.,Baker R. K., Berkovich S. - The Synthesis of Radioactive Fluorescein Isothiocyanate. - Immunology, 1966, 11, 321.
8.   Charles G. G., Pamela K. H., Steven D. R. - Preparation and Properties of Fluorescent Polysaccharides. Anal. Biochem., Vol 130, p.p. 287-294, 1983.
9.  Potapova O. V., Shkurupiy V. A. - Effect of Dialdehyde Dextran on Structural Changes in the Liver and Lungs during Chronic BCG Granulomatosis. – Bul. of Ex. Bio. and Med., Vol. 146, No. 6, 2008.
10.   Usov D., Sukhorukov G.D. - Dextran Coatings for Aggregation Control of Layer-by-Layer Assembled Polyelectrolyte Microcapsules. – Langmuir 2010, Vl. 26(15), p.p. 12575–12584.