Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск
Structural Biology Group, Jozef Stefan Institute, Ljubljana, Slovenia
Эта работа опубликована в сборнике статей по материалам Международной 64-й научной студенческой конференции им. Н.И. Пирогова (г.Томск, 2005 год) под редакцией проф. Новицкого В.В. и д.м.н. Огородовой Л.М.
Скачать сборник целиком (1 мб)
Установление пространственной структуры белка является ключевым этапом в понимании механизмов функционирования белковой молекулы. Для достижения атомарного разрешения при визуализации белка необходимо использовать электромагнитное излучение с длиной волны в 1 Å - рентгеновское излучение. По существу рентгеновская кристаллография представляет собой микроскопию с очень высоким разрешением. Полученные в ходе кристаллографического исследования сведения позволяют понять как белки взаимодействуют с другими молекулами, как они претерпевают конформационные изменения и как они катализируют различные биохимические реакции в случае ферментов [1].
Установление трехмерной структуры белка методом рентгеновской кристаллографии включает выращивание высокоупорядоченных кристаллов исследуемого белка, измерение дифракционных картин рентгеновских лучей на этих кристаллах и использование программного обеспечения для получения трехмерной картины белка [2]. Поскольку рентгеновские лучи дифрагируют на электронах в белковом кристалле, то результатом рентгеноструктурного исследования является трехмерная карта, показывающая распределение электронов в белковой молекуле. На конечном этапе исследования аминокислотная последовательность исследуемого белка упаковывается в полученную электронную плотность, в результате чего проясняется трехмерная структура белка. На основе пространственной структуры фермента строятся модели его взаимодействия с субстратами и ингибиторами.
Основной целью работы было освоение и применение в исследованиях новых методик белковой кристаллографии с целью установления пространственной конфигурации белковых молекул и построения на их основе моделей биохимической и физиологической активности исследуемых белков и пептидов. Теоретические выкладки подтверждались на практике серией экспериментов по установлению конфигурации ряда белков с высоким разрешением (около 2 Å).
В ходе работы анализировались данные полученных карт электронной плотности белка в виде 3D структуры, а также выполнялось последовательное уточнение макромолекулярных структур с помощью современного программного обеспечения. В ходе установления конфигурации белковой молекулы значительную роль играет применение компьютерной графики высокого качества и эффективности с целью визуализации макромолекул и более эффективной работы кристаллографа. Последовательное уточнение макромолекулярных модельных структур, а также укладка полипептидной цепи белка в полученную карту электронной плотности в ходе исследований осуществлялись с помощью современного программного обеспечения MAIN [3], разработанного Dr. Dusan Turk в Jozef Stefan Institute (IJS). Эта уникальная, разработанная в IJS программа является высокофункциональной и используется также для построения окончательной модели пространственной структуры исследуемого белка и для ее оценки.
В ходе выполнения работы, экспериментально на практике с применением новых методик был закристаллизован белок - гидролаза Lysozyme (лизоцим) яичного белка курицы (Serva EC 3.2.1.17) [4]. Данные дифракции рентгеновских лучей на его кристаллах были получены при комнатной температуре, а также с использованием крио-системы (Cryostream Cooler) [5]. Первоначальный массив данных был затем проанализирован (проиндексирован, установлена пространственная группа кристалла, уточнен, интегрирован и градуирован с помощью пакета программ HKL2000). Проблема отсутствия фаз была решена с использованием метода молекулярного замещения (Molecular Replacement Method). Проанализированный с помощью HKL2000 полученный экспериментально массив данных был сравнен с имеющимся в Protein Data Bank ранее установленным модельным вариантом - 1AZF. Сравнение осуществлялось с помощью AMoRe server, поддерживаемого Structural Biology Group, IJS, и разработанного одним из ее членов - Miha Andrejasic.
Полученная модель с известными после этой операции фазами далее подверглась многократному уточнению с помощью MAIN software. На конечном этапе уточнения структуры молекулы лизоцима и укладки его полипептидной последовательности в имеющуюся электронную плотность R-фактор, являющийся характеристикой качества модели, снизился значительно от 30% до 20%, а разрешение модели приблизилось к 2 Å. Разрешение 1,5 – 2 Å является желаемым для белков, поэтому полученные данные использовались далее для визуализации полученной трехмерной структуры белка и построения моделей взаимодействия лизоцима с субстратом и ингибиторами (tri-NAG inhibitor). Аналогичные операции были проделаны для установления структуры других белков (hTAP, clitocipin).
Таким образом, применение новых модифицированных методик кристаллизации белков, внедренных в Structural Biology Group, и использование современного программного обеспечения MAIN для последовательного уточнения макромолекулярных модельных структур позволило достичь следующих результатов – были получены трехмерные модели белков (Lysozyme, TAP – tokoferrol associated protein) c высокими разрешениями ( 2 Å), низким R-фактором и в предельно короткий срок. Кроме того, использование MAIN дало возможность смоделировать взаимодействие активных участков ферментов с их ингибиторами: лизоцима с tri-NAG, clitocipin с papain.
Представленная работа является результатом сотрудничества между кафедрой биохимии и молекулярной биологии Сибирского Государственного Медицинского Университета и отделением биохимии и молекулярной биологии Jozef Stefan Institute, Ljubljana, Slovenia. Результаты данной работы планируется использовать в качестве основы методического руководства для обучения аспирантов и новых сотрудников Structural Biology Group в Jozef Stefan Institute и, возможно, СибГМУ.
Список литературы:
1. Rhodes, Gale. Crystallography made crystal clear. A guide for users of macromolecular models. Second edition. Academic Press, 1993: 5-85
2. Drenth, Jan. Principles of protein X-Ray crystallography, Springer-Verlag New York, Inc.; 1994: 1-19.
3. Turk D., MAIN 96: An interactive software for density modifications, model building, structure refinement and analysis. Proceedings from the 1996 meeting of the International Union of Crystallography Macromolecular Computing School, eds P.E. Bourne & K. Watenpaugh
4. Protein Crystallization: Techniques, Strategies, and Tips, A Laboratory Manual/ edited by Terese M. Bergfors (IUL Biotechnology Series), International University Line; 1999:3-17.
5. Psakhie I. X-ray crystallography summer training course report. Jozef Stefan Institute, Structural Biology Group, Ljubljana, Slovenia, July 2004.
|