Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск
Учреждение Российской Академии Медицинских наук НИИ Кардиологии СО РАМН

Эта работа опубликована в сборнике статей по материалам Международной 68-й научной итоговой студенческой конференции им. Н.И. Пирогова (г.Томск, 20-22 апреля, 2009 год); под реакцией академика РАМН В.В. Новицкого, член. корр. РАМН Л.М. Огородовой

Посмотреть титульный лист сборника

Скачать сборник целиком (1,5 мб)

 

Концепция регенеративной медицины, базирующаяся на использовании собственных стволовых клеток (СК) для восстановления поврежденных тканей и органов, в последние годы привлекает внимание большого количества исследователей. Клеточная кардиомиопластика может являться альтернативой многим известным методам лечения заболеваний сердца, в частности лечения инфаркта миокарда. В настоящее время показана возможность улучшения функциональной активности пораженного миокарда при интрамиокардиальной трансплантации клеток костного мозга (КМ) [2]. Но обоснование терапевтических эффектов трансплантации клеток требует определенных доказательств, и прежде всего, присутствия клеток в зоне трансплантации.
Цель. Изучить присутствие колониеобразующих клеток в миокарде крыс после деструктивного воздействия и интрамиокардиальной трансплантации клеток костного мозга.
Материалы и методы. Работа выполнена на 40 крысах-самцах линии «Вистар» массой 250-300 г. Патологию сердца моделировали методом криодеструкции (КД) [1] у 20 животных, в результате чего к 40 суткам у них развивался постинфарктный кардиосклероз (ПИКС). Через 7 суток 10-ти животным с КД интрамиокардиально вводили 100 мкл культуральной среды, содержащей 1-2х106кл/мл мононуклеаров (МН). МН выделяли из КМ бедренных костей 2-х животных. На 30-е сутки после трансплантации всех опытных и 10 интактных животных умерщвляли. Регистрировали весовые показатели самих крыс, их сердец и левого желудочка (ЛЖ).
Способность клеток перенести трансплантацию оценивали по содержанию в миокарде животных колоногенных клеток (КОК) [3] на 30-е сутки после трансплантации. Для этого животных умерщвляли и в стерильных условиях выделяли ЛЖ сердца. После гомогенизации миокарда полученную взвесь помещали в культуральные флаконы и культивировали по модифицированному методу Makino et al. [4] в стерильном СО2-инкубаторе при 37о С, 100% влажности, 5% СО2.  Спустя 16 суток питательную среду удаляли, а содержимое флаконов фиксировали и окрашивали. Оценивали в них количество образовавшихся колоний (количество клеток на колонию n>50) и общую клеточность.
Для анализа состояния пула КОК использовали КМ 4-х интактных и 4-х животных с ПИКС. С этой целью культивировали предварительно выделенные МН по стандартной схеме [4]. На 14 сутки культивирования питательную среду удаляли, а содержимое флаконов фиксировали и окрашивали. Подсчитывали в них количество колоний и общую клеточность.
Результаты исследования. Проведенные исследования по сравнению весовых показателей крыс показали, что вес тела интактных и животных с ПИКС достоверно не различался. Однако в опытной группе через 40 дней после КД вес сердца и ЛЖ увеличился в среднем в 1,6 раз по сравнению с группой интактных животных, что обусловлено гипертрофией ЛЖ и формированием в сердечной мышце соединительнотканного рубца. При этом вес рубцовой ткани составил в среднем 111,10 ± 1,44 мг. Таким образом, ПИКС, вызванный КД в нашем эксперименте, как и многие патологические изменения в сердце сопровождается процессом ремоделирования – рядом последовательных адаптационных структурно-функциональных изменений мышцы сердца в результате ее повреждения. Эти процессы затрагивают как инфарцированный участок, так и здоровый миокард. Инфарктная зона постепенно растягивается и подвергается рубцеванию, а непораженные участки ЛЖ гипертрофируются, обуславливая увеличение его массы [1].
Для оценки влияния КД на состояние пула КОК КМ были проведены эксперименты с культивированием клеточной массы КМ интактных и животных с ПИКС в условиях in vitro. Во флаконах, где производился посев клеток КМ интактных животных, выросло 27+/-7 колоний, а общая клеточность составила 2930+/-253 кл/см2. В культурах клеток КМ животных с ПИКС данные показатели изменились. Так, число колоний увеличилось в 1,7 раз, а клеточность – в 1,2 раза и составили 46+/-9 и 3520+/-246 кл/см2 соответственно. Увеличение клеточности и количества колоний в опытной группе по сравнению с результатами интактной группы свидетельствует об активации резервных сил организма в ходе развития ПИКС. В обычных условиях процессы физиологической регенерации сердечной ткани осуществляются за счет собственных СК. При развитии патологического состояния собственного резерва миокарда не хватает, поэтому происходит индуцированная мобилизация стромальных клеток КМ и поступление их в кровоток. Достигнув области поврежденной ткани, эндогенные СК начинают пролиферировать и дифференцироваться в соответствующем локальному микроокружению направлении, играя роль дополнительного пластического материала [2]. Однако даже этих эндогенных факторов в условиях патологических изменений миокарда оказывается недостаточно, поэтому восполнение дефицита клеток возможно только при использовании клеточных трансплантатов.
В нашей работе в качестве клеточного трансплантата использовались МН. Способность клеток перенести трансплантацию оценивали по содержанию в миокарде животных КОК на 30-е сутки после трансплантации. При культивировании миокарда интактных животных была обнаружена 1 колония клеток при общей клеточности препаратов 251+/-57 кл/см2.
При культивировании миокарда животных с ПИКС колонии отсутствовали, а общая клеточность составила 14+/-7 кл/см2. Снижение содержания КОК в этой группе свидетельствует о том, что пул клеток практически весь был задействован для восстановления сердечной мышцы. Можно сказать, что повреждение миокарда, видимо, не явилось значимым фактором, стимулирующим эндогенные механизмы, ответственные за мобилизацию и хоуминг СК из других тканей организма и в первую очередь КМ.
В тоже время, при культивировании миокарда животных с КД и последующей трансплантацией МН было обнаружено 3+/-1 колонии при общей клеточности препаратов 278+/-96 кл/см2. Таким образом, трансплантация МН обеспечила нормализацию и поддержание пула КОК на уровне интактного миокарда, однако не явилась достаточным условием для осуществления полной заместительной клеточной трансплантации.
Заключение. Проведенные исследования показали, что деструктивное повреждение миокарда, видимо, не является значимым фактором, стимулирующим эндогенные механизмы, ответственные за мобилизацию и хоуминг стволовых клеток, как самого миокарда, так и костного мозга. Трансплантация мононуклеарной фракции клеток костного мозга обеспечивает нормализацию и поддержание пула колониеобразующих клеток на уровне интактного миокарда, однако не является достаточным условием для осуществления полной заместительной клеточной трансплантации.

Список литературы:
1.    Клеточная кардиомиопластика (аналитический обзор) / И. В. Потапов, М. Е Крашенинников, Н. А. Онищенко и др. // Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2001. - № .2 - С. 46-53.
2.    Стволовые клетки и кардиомиогенез в норме и патологии / В. П. Шахов, С. В. Попов. – Томск : STT, 2004. – 170 с.
3.    Фармакологическая регуляция функциональной активности стволовых клеток при восстановлении миокарда в постинфарктном периоде / Л. А. Ставрова, Г. И. Фомина, М. Б. Плотников и др. // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2005. - № 4. - С. 190-194.
4.    Makino, S. Cardiomyocytes can be generated from marrow stromal cell in vitro / S. Makino, K. Fukuda, S. Miyoshi et al // J. Clin. Invest – 1999. – Vol. 103. – P. 697-705.