1Степанов    Г.В.,1Прошин   С.Н.,*1Кравцов В.Ю.,  3Паранян   И.А., 2Косякова Г.П.,  2Яковлев А.Ф.
*1Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины МЧС России, Отдел молекулярной диагностики и клеточной патологии 2,3Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения с.-х. животных,
Лаборатория молекулярной цитогенетики, Лаборатория генофонда (г. Санкт-Петербург)

Эта работа опубликована в сборнике научных трудов «Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии» (2004 год, выпуск 1), под редакцией проф., д.м.н. Ильинских Н.Н. Посмотреть титульный лист сборника

    Целостность ДНК в сперматозоидах является важным показателем, обусловливающим фертильность человека и животных. Существующие в организме механизмы элиминации повреждённых сперматозоидов позволяют создать естественный барьер для селекции генетического материала и неполноценных спермиев. Для оценки качества спермы, как правило, используют такие показатели, как общее количество сперматозоидов в эякуляте и их концентрацию, подвижность и различные аномалии формы сперматозоидов, а также ряд других факторов, включая pH семенной жидкости и т.д. [1]. Указанные показатели адекватно оценивают состояние спермы, однако, прямо не учитывают собственно структурную целостность генома сперматозоидов. В настоящее время для того, чтобы оценить целостность ДНК сперматозоидов используется метод, основанный на чувствительности ДНК к кислотной денатурации (с последующей оценкой соотношения интактной и денатурированной ДНК методом проточной цитометрии) и метод, вовлекающий ферментативное мечение свободных 3' ОН концов ДНК сперматозоидов с флюоресцентным субстратом [2]. Ещё одним методом, относительно недавно используемым для оценки целостности ДНК является микроэлектрофорез ДНК одиночных клеток, хорошо зарекомендовавший себя в генотоксических тестах на соматических клетках [3]. Несомненным преимуществом последнего метода является возможность учёта как уже возникших разрывов ДНК (одно- и двунитиевых), так и сайтов ДНК сперматозоидов, которые являются потенциальным источником однонитиевых разрывов, то есть щелочелабильных сайтов. Возможность выявления щелочелабильных сайтов особенно актуальна, учитывая нарастающее количество веществ, потенциально вызывающих оксидативное повреждение ДНК. Кроме того, фактором, способным потенциально вызвать оксидативное повреждение ДНК сперматозоидов является криоконсервация спермы и этим метод “микроэлектрофореза ДНК одиночных клеток (сперматозоидов)” может быть особенно информативен для мониторинга качества замораживания спермы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Было обследовано четыре пациента (в возрасте от 25 до 35), проходивших комплексное андрологическое обследование в урологическом кабинете Всероссийского центра экстренной и радиационной медицины МЧС России. В качестве положительного контроля был использован эякулят четырёх здоровых мужчин в аналогичном возрастном диапазоне. Для оценки влияния криоконсервации (и длительности хранения спермы при криоконсервации) на целостность ДНК сперматозоидов были исследованы образцы спермы быков. Этот материал сохраняется во Всероссийском научно-исследовательском институте генетики и разведения с.-х. животных. Методом ДНК-микроэлектрофореза была исследована размороженная сперма быков после 20 лет хранения (5 особей) и с продолжительностью хранения менее одного года (5 быков). После получения эякулята сперматозоиды были отмыты в фосфатно-солевом буфере, ресуспендированы в TES буфере из расчёта 5000 сперматозоидов на 100 мкл и проинкубированы с протеиназой К в концентрации 100 мкг на мл буфера в течение часа при 37 єС. Далее 15 мкл буфера, содержащего обработанные протеиназой К (ICN) клетки были смешаны с 75 мкл легкоплавкой агарозы (ICN) и немедленно нанесены на матированное стекло, предварительно обработанное слоем 1% нормальной агарозы (ICN). Далее, приготовленный таким образом “пирог” был помещён в лизирующий раствор (pH 10), содержащий 1% Triton X-100 и 10% диметилсульфоксид (ICN) и проинкубирован в темноте в течение часа при 4є С. По окончании инкубации в лизирующем растворе препараты были помещены на 40 мин. в камеру для горизонтального электрофореза (BioRad), содержащую буфер для электрофореза (pH>13). Далее был проведён электрофорез препаратов в течение 25 мин. при напряжении 0,74 В на см при силе тока 300 млА. По окончании электрофореза препараты были обработаны в буфере для нейтрализации (pH ~7,4), окрашены акридиновым оранжевым и проанализированы под флюоресцентным микроскопом (Leitz Aristoplan). В каждом случае было проанализировано не менее 200 клеток. Частота сперматозоидов с визуально определяемыми нарушениями целостности ДНК был выражен в процентах. Сперматозоиды с нарушенной целостностью ДНК определялись как клетки, образующие хвост в виде “кометы”.
РЕЗУЛЬТАТЫ. Проведённое исследование показало, что частота сперматозоидов с признаками нарушения целостности ДНК в группе обследованных пациентов варьировала от 3 до 9% и в среднем составила 6±1,5%. В контрольной выборке нарушение целостности ДНК сперматозоидов не превышало 6%, а средняя по группе 4±0,9%. Однако, следует отметить, что наблюдаемые различия между контрольной группой (4±0,9%) и обследованными пациентами (6±1,5%) не различалась достоверно (P>0,05). Данные, полученные с помощью микроэлектрофореза ДНК сперматозоидов были сопоставлены с результатами спермограммы. Среди обследованных пациентов в двух случаях была выявлена нормоспермия, в одном случае астеноспермия и в четвёртом случае невыраженная олигоспермия. В последнем случае концентрация сперматозоидов составляла 49 млн./мл. Среди контрольной группы только в одном случае из четырёх была обнаружена полиспермия. Вместе с тем, следует отметить, что ни в одном из восьми случаев, включая обследованных пациентов, не было обнаружено выраженных изменений морфологии сперматозоидов, т.е. частота морфологических аномалий сперматозоидов не превышала 50%.
    Исследование целостности ДНК при криоконсервации семени животных показало, что целостность ДНК сперматозоидов быков при хранении спермы более 20 лет составляет 4,3±0,5%, а при хранении менее одного года - 3,1±0,9%. Несмотря на достаточно существенную разницу: около 1,2%, различия оказались статистически недостоверными (P>0,05). Возможно, на статистические показатели повлияла небольшая выборка быков. Однако, полученные различия дают основания использовать предлагаемый подход для дальнейшего исследования состояния ДНК при длительном хранении спермы в жидком азоте в связи с оценкой её репродуктивной ценности.
    Полученные результаты по оценке целостности ДНК сперматозоидов методом микроэлектрофореза согласуются с данными зарубежных авторов, которые указывают, что в норме нарушение целостности ДНК не превышает 20% [3, 4], а более высокая частота нарушений является фактором препятствующим осуществлению нормальных репродуктивных функций. Таким образом, несмотря на то, что достоверных различий в проведённом нами исследовании не было выявлено, дальнейшее использование метода микроэлектрофореза ДНК сперматозоидов вместе с исследованием спермограммы пациентов является перспективным, так как позволяет проводить комплексное андрологическое обследование репродуктивного здоровья пациентов и требует дальнейшего исследования и увеличения выборки пациентов, включая мужчин с выраженными аномалиями сперматозоидов, делая акцент на секреторную форму нарушения репродуктивных функций. В том числе данный подход может быть успешно использован для мониторинга качества криоконсервации мужского семени, а также оценки влияния генотоксических факторов на геном сперматозоидов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
[1] Евдакимов В.В., Раков С.С., Липатов Н.А. и др. (1995) Комплексное лабораторное исследование эякулята при заболеваниях мужской репродуктивной системы. Клиническая лабораторная диагностика, 6, 114-116.

[2] Manicardi, G.C., Bianhci, P.G. Pantano, S Azzoni, P., Bizzaro D., Bianchi, U. and Sakkas, D. (1995) Presence of endogenous nicks in DNA of ejaculated human spermatozoa and its relationship to chromomycin A3 accessibility. Biol. Reprod., 52, 864-867.

[3] Morris, I.D., Ilott, S., Dixon, L., and D.R. Brison (2002) The spectrum of DNA damage in human spermatozoa assessed by single cell gel electrophoresis (Comet assay) and its relationship to fertilization and embryo development. Hum. Reprod., 17, 101-109.
[4] Singh, N.P., Danner, D.B., Tice, R.R., McCoy, M.T., Collins, G.T. and E.L. Schneider (1989) Abundant alkali-labile sites in human and mouse sperm DNA. Exp. Cell. Res., 184, 461-466.