|
Самарский государственный университет (г. Самара) Эта работа опубликована в сборнике научных трудов «Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии» (2004 год, выпуск 1), под редакцией проф., д.м.н. Ильинских Н.Н. Посмотреть титульный лист сборника
Статья посвящена изучению влияния экзогенных генераторов NO: нитрита натрия и 1,2,3-оксадиазоло[3,4-d]пиразин-1,5,6-триоксида (FPTO) в присутствии цистеина на систему гемоглобина и активность ферментов гликолиза. Установлено, что генераторы NO, действующие на интактную клетку из вне, снижают активную концентрацию глицеральдегидфосфатдегидрогеназы (ГАФД) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ), что сопровождается снижением образования 2,3 ДФГ. Эффект усиливается в присутствии цистеина и закисления. Также наблюдается ускорение метгемоглобинобразования и увеличение фракции мембраносвязанного гемоглобина. Полученные данные доказывают негативное действие экзогенных генераторов NO на эритроцитарные клетки. Причем ингибирование преимущественно мембранной фракции ГАФД позволяет предположить, что подвергающиеся S-нитрозилированию белки мембран являются непосредственными мишенями экзогенного NO.
Введение
В настоящее время считается доказанным, что оксид азота является биологическим посредником с широким спектром биорегуляторного влияния [1,2,3]. Эффекты окиси азота реализуются через повышение внутриклеточной концентрации cGMP с участием тиолов и гемапротеинов, глутатион-S-трансферазы и других ферментов [4,5]. Внутриклеточными мишенями оксида азота и его производного – пероксида азота – становятся гемоглобин и другие гемсодержащие белки, NO-синтазы (ингибируются избытком NO) и NAD-зависимые дегидрогеназы, подвергающиеся S-нитрозилированию [6]. Однако, генераторы NO остаются основными препаратами, применяемыми для коррекции ишемических состояний. Действие экзогенных генераторов окиси азота, особенно в присутствии тиолов и закислении, может значительно повлиять на метаболические системы клеток.
Целью настоящего исследования стало изучение влияния нитрита натрия и генератора NO фураксановой природы в присутствии тиолов и избытка протонов на систему гемоглобина и активность NAD-зависимых дегидрогеназ.
Методика исследований
Для исследований использовалась цельная донорская кровь или фракция чистых эритроцитов (отмывка 0,154 М раствором NaCl,, рН 7,0, 40С; режим центрифугирования – 600g, 10 минут). В цельную кровь или суспензию эритроцитов в среде Рингера-Локка (1: 1) добавляли нитрит натрия (2 мМ) и цистеин (1 и 2 мМ). Условия закисления имитировали добавлением 7,5 мМ лактата натрия [7]. В качестве возможного генератора NO использовали также фураксановое производное 1,2,5-оксадиазо[3,4-d]пиридин-1,5,6-триоксид (FPTO) в концентрациях 10-50 мкМ. Инкубацию проводили при 370С в течение 3-10 минут. Содержание метгемоглобина определяли, используя максимум поглощения [8], мембраносвязанного гемоглобина по методу [9]. Среда инкубации для определения активности ГАФД содержала: 100 мМ глицина, 50 мМ калий-фосфатного буфера, 5 мМ ЭДТА, 0,5 мМ NAD+, 0,5 мМ 3-фосфоглицериного альдегида, рН 8,9. Для получения мембранной фракции ГАФД лизат эритроцитов, полученный добавлением равного объема дист. воды, центрифугировали (20.000 g, 15 минут, 40С). Надосадочная жидкость использовалась как цитозольная фракция, осадок мембран ресуспендировали в равном объеме 0,9% NaCl и использовали для определения активности мембраноассциированной ГАФД. Среда для определения активности ЛДГ содержала 0,1 М калий-фосфатного буфера, 5 мМ ЭДТА, 2 мМ пирувата, 0,2 мМ NADH, рН 7,0. Длина волны 340 нм. Активность выражали в мкМ NAD+ или NADH в минуту. Концентрацию 2,3-дифосфоглицерата (2,3-ДФГ) определяли спектрофотометрически в сопряженной системе ГАФД, 3-фосфоглицераткиназы и фосфоглицератмутазы. Среда измерения содержала: 0,05М триэтаноламин-НСl, рН 7,5; 1мМ АТР, 1мМ MgCl2, 0,25 мМ NADH, 1,6 ед/мл ГАФД, 1,6 ед/мл 3-фосфоглицераткиназы, 0,5 ед/мл фосфоглицератмутазы, 1 мМ 2-фосфогликолевой кислоты. Длина волны 340 нм.
Результаты и обсуждение
Действие нитрита натрия в эквимолярной с цистеином концентрации приводит к значительному росту скорости метгемоглобинобразования и увеличению содержания мембраносвязанного гемоглобина. Условия закисления усугубляют метгемоглобинобразующее действие нитрозотиолов (табл.1). Увеличение процента метформы гемоглобина связано, прежде всего, с прямым влиянием нитританионов на гемоглобин. Известно, что избыток протонов активирует этот процесс. Есть данные также о том, что в условиях закисления цистеин становится прооксидантом [10,11].
Кроме прямого нитризилирующего воздействия генератов NO на гемоглобин, в клетке реализуются и другие эффекты, обусловленные присутствием окиси азота и его производных. Увеличение фракции мембраносвязанного гемоглобина свидетельствует о повреждении мембранных структур эритроцитарной клетки. Окислительное повреждение мембраны создает условия для бòльшего заглубления гемоглобина в липидный бислой. Особенно жестко внедряется в мембрану метгемоглобин [12]. Рост содержания метформы гемоглобина и мембраносвязанного гемоглобина может быть следствием не только прямого действия окиси азота на гемоглобин, но и влиянием его на метаболические процессы в клетке. Действительно, проведенные исследования с использованием в качестве генератора NO фураксанового производного FPTO, выявило ингибирующее действие его на активность глицероальдегидфосфатдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы эритроцитов человека. Ингибирование наблюдается в мембранной фракции ГАФД, тогда как в цитозольной обнаруживается только тенденция к снижению активности (табл.2).
Полученные данные свидетельствуют о первоочередным воздействии FPTO на мембранные белки, в том числе на ГАФД. Особый интерес вызывает тот факт, что мембраносвязанный фермент не проявляет дегидрогеназной активности, хотя концентрация ГАФД составляет 10% от всех водорастворимых белков в клетке. Возможно, мембраносвязанная форма ГАФД выполняет протекторную роль, связывая NO и его производные в активном центре. В отличие от действия перекисных соединений, окись азота приводит к необратимому ингибированию ГАФД. Что касается ЛДГ, то ее активный центр не содержит сульфгидрильных групп чувствительных к NO и прямое воздействие на каталитическую активность ЛДГ мало вероятно. Этим объясняется появление достоверного снижения активности только с увеличением концентрации FPTO, тогда как степень ингибирования ГАФД не зависит от увеличения концентрации генератора NO (табл.2). Опосредованное действие окиси азота может проявляться в нитрозилировании остатков тирозина, серина, треонина белковой молекулы, что ведет к денатурационным изменениям и усилении неспецифической агрегации ЛДГ. Об общем снижении интенсивности энергетических процессов в эритроцитах свидетельствует уменьшение производства 2,3 ДФГ, так как скорость его образования зависит от уровня протонов (табл.2).
Таблица 1. Влияние нитрозотиолов на скорость метгеоглобинобразования и содержание мембраносвязанного гемоглобина в эритроцитах человека, n= 20 | Пробы | Метгемоглобин,% | Мембраносвязанный гемоглобин, % | | 1. Контроль | 1, 66±0,18 | 5,03±0,20 | | 2. Цис.,2 мМ + NaNO2, 2мМ, | 3,24±0,09* | 7,68±0,27* | | 3. Цис.,2 мМ + NaNO2, 2мМ + Lactat, 7,5 мМ | 3,87±0,15** | 13,42±0,36** | Примечание *P<0,01 по отношению к контролю; **P<0,01 по отношению к пробе цистеин+ NaNO2 Таблица 2. Активность NAD-зависимых дегидрогеназ и содержание 2,3 ДФГ при воздействии FPTO на эритроциты человека, n=40 | Пробы | Активность мембранной ГАФД, мкМ/мин | Активность цитозольной ГАФД, мкМ/мин | Активность ЛДГ, мкМ/мин | Содержание 2,3 ДФГ, мМ | | 1. Контроль | 4,9±0,3 | 4,5±0,4 | 31,5±1,57 | 2,1±0,10 | | 2. FPTO, 10 мкМ | 3,1±0,3* | 4,0±0,7 | 28,8±1,44 | 1,0±0,32 | | 3. FPTO, 50 мкМ | 3,0±0,2* | 4,0±0,6 | 22,0±1,1* | 1,0±0,05* | Примечание *P<0,05 по отношению к контролю
Анализ полученных результатов позволяет заключить, что повреждающее действие экзогенного NO может усиливаться в присутствии тиолов на фоне избытка протонов, основной мишенью становится мембрана эритроцитов. Процесс повреждения мембраны приводит к значительному усилению метгемоглобинобразования и ухудшению функциональной активности эритроцитов. Мембраносвязанная ГАФД может связывать значительные количества окиси азота в активном центре, возможно, играя протекторную роль в защите клетки от повреждающего влияния окиси и пероксида азота.
Список использованной литературы:
1. Bredt D.S. , Snyder S.H. Nitric oxide: a physiologic messenger molecule // Annu.Rev.Biockem. 1994. V. 63. P.175-195.
2. Hecker M. Endothelioum – derived hyperpolarizing factor – fact or fiction? // News in physiological sciences. 2000. V.15. P.1-6.
3. Lowenstein C.J., Snyder S.H. Nitric oxide, a novel biologic messenger // Neuron. 1992. N8. P. 705-707.
4. Kosaka H., Uozumi M., Tyuma I. The interaction between oxides and hemoglobin and endothelium-derived relaxing factor // Free Radical Biology & Medicine. 1989. V.7. P.653-658.
5. Kuo P., Abe K. Nitric oxide-associated regulated of hepatocyte glutatione synthesis is a guanylyl cyclase-independend event // Surgery. 1996. V. 120. P. 309-314.
6. Lee J. McDonald and Joel Moss Nitric oxide fnd NAD-dependend protein modification // Mol.and Cell. Biochem. 1994. N138. P.201-206.
7. Boning D., Hollnadel Ch., Boecker A. The bohr effect of lactic acid in vitro simulation of oxereise // 31 Int. Cong. Phisiol. Sci., Helsinki. 9-14 July. 1989. P. 256-257.
8. Заводник И.Б., Лапшина Е.А. Процессы окисления гемоглобина человека // Биохимия. 1996. Т.61. №1 С.42-48.
9. Токтамысова З.С., Биржанова Н.Х. О мембраносвязанном гемоглобине // Биофизика. 1990. Т.35. №6. С.1019-1020.
10. Мышкин А.Е. Окисление гемоглобина // Успехи химии. 1984.№6. С.1045-1071.
11. Зенков Н.К., Менщикова Е.Б., Вольский Н.Н. Внутриклеточный окислительный стресс и апоптоз // Усп.совр.биологии. 1999. №5. С.440-450.
12. Слобожанина Е.И., Черницкий Е.А., Козлова Н.М. Содержание внутриклеточного АТФ и структурное состояние белков в эритроцитарной мембране //Биофизика.1982.Т.27. №3. С.425-429.
|
