Эта работа опубликована в сборнике статей по материалам 70-й Юбилейной итоговой научной студенческой конференции им. Н.И. Пирогова (г. Томск, 16-18 мая 2011 г.), под ред. В. В. Новицкого, Л. М. Огородовой. − Томск: Сибирский государственный медицинский университет, 2011. − 430 с.

 

Скачать сборник (формат MS Word, 7,3 мб)

Посмотреть основную информацию о сборнике, обложку и т.д.

 

Актуальность: проблема онкологических заболеваний по-прежнему остается важной для современного общества. Онкология, по данным ВОЗ, занимает второе место среди причин смертности в мире после сердечно-сосудистых заболеваний. В последние годы наблюдаются определенные успехи в лечении онкологических больных, но, несмотря на это, противоопухолевая терапия не является совершенной и имеет множество побочных действий. Перспективным направление для создания новых противоопухолевых средств является модуляция программированной клеточной гибели (апоптоза). Как известно, реализация танатогенной программы зависит от соотношения индукторов и ингибиторов апоптоза, а также от регуляторных внутриклеточных механизмов. К ним можно отнести как постоянно существующие в клетке белки, так и индуцируемые стрессом молекулы. Важное значение среди последних имеют белки теплового шока (Hsp – Heat shock proteins), повышенная экспрессия которых наблюдается в опухолевых клетках по результатам многочисленных исследований [1]. Также в последнее время появились данные о неоднозначной роли Hsp в регуляции программированной клеточной гибели [2]. Таким образом, исследование молекулярных путей воздействия данных белков на реализацию апоптоза открывает новые перспективы в разработке таргетного подхода лечения опухолей.

Цель: оценить особенности реализации апоптоза опухолевых клеток линии Jurkat в условиях ингибирования белка теплового шока 27 кДа (или Hsp27).

Материал и методы: исследования выполнены на опухолевых клетках линии Jurkat (T – лимфобластоидная линия клеток человека), полученных из Российской коллекции клеточных культур института цитологии РАН (г. Санкт-Петербург), и мононуклеарных лейкоцитах, выделенных из венозной крови здоровых доноров (10 мужчин и 16 женщин в возрасте от 18 до 45 лет) путем центрифугирования на слое «Ficoll-Paque» плотностью 1,077. Опухолевые клетки культивировали суспензионным методом в среде RPMI-1640, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, гентамицин (100мкг/мл) и L–глутамин (0,3мг/мл) в СО₂ –инкубаторе при 37ºС в атмосфере 5% СО₂.

Мононуклеарные лейкоциты и опухолевые клетки инкубировали в присутствии селективного ингибитора Hsp27 – KRIBB3 (5-(5-ethyl-2-hydroxy-4-methoxyphenyl)-4-(4-methoxyphenyl)-isoxazole) (в концентрации 0,1мкМ), и этопозида (в концентрации 8мкг/мл), в течение 18 часов.

Апоптоз оценивали аннексиновым тестом (Annexin V Fitc, «Beckman Coulter», США) с помощью флуоресцентной микроскопии. Содержание белков семейства Bcl-2 определяли методом вестерн-блоттинга, с использованием первичных антител к Bcl-2, Bax, Bad, Hsp27, фосфо-Hsp27 («Sigma», США). С помощью проточной цитофлуорометрии оценивали изменение величины митохондриального потенциала.

Результаты: при культивировании опухолевых клеток с KRIBB3 количество апоптотически измененных клеток достоверно увеличивалось в 6 раз по сравнению с интактной культурой (р < 0,05). При этом содержание проапоптотического белка Bax повышалось, а антиапоптотического Bcl-2 – достоверно уменьшалось в 1,5 раза. Известно, что Hsp27 обладает антиапоптотическим эффектом, блокируя реализацию рецептор-опосредованного и митохондриального путей апоптоза. Ингибирование функциональной активности белка теплового шока 27 в опухолевых клетках линии Jurkat облегчает проведение апоптотического сигнала. Одним из механизмов цитопротективного действия является изменение соотношения про- и антиапоптотических белков семейства Bcl-2. Показано, что активная форма Hsp27 индуцирует транскрипционный фактор NF-kB, который стимулирует экспрессию антиапоптотических белков (Bcl-2, Bcl-XL и c-IAPs) Так, при блокировании белка Hsp27 может происходить инактивация NF-kB, приводящая к снижению экспрессии Bcl-2. Это способствует выходу Bax из гетеродимерного комплекса Bax/Bcl-2 и реализации его проапоптотической функции [3]. В группе здоровых доноров при добавлении ингибитора Hsp27 содержание апоптотических клеток не изменялось относительно контроля. Тогда как инкубирование с этопозидом приводило к увеличению в 2 раза количества апоптотически измененных мононуклеарных лейкоцитов здоровых доноров и в 6 раз – опухолевых клеток линии Jurkat, по сравнению с интактными клетками. При сочетании данных условий наблюдалось повышение числа Fitc-меченных клеток в 2 раза как при Т-лимфобластном лейкозе, так и в клетках здоровых доноров по сравнению с культурами с этопозидом или ингибитором Hsp27.

Выводы: Hsp27 является модулятором программированной клеточной гибели и его ингибирование приводит к снижению резистентности опухолевых клеток линии Jurkat к апоптозу. Дальнейшее изучение действия ингибитора белка теплового шока 27 на реализацию апоптоза опухолевых клеток позволит создать новые подходы к лечению онкологических заболеваний.