Авторы: Карагодин В.П., Собенин И.А., Мухамедова Н.М., Мельниченко А.А., Смутова В.А., Орехова В.А.,  Мясоедова В.А., Никифоров Н.Г., Сюсина М.А., Горшкова Т.Н,  Бордачев Е.Н., Ромкина А.Ю., Орехов А.Н.

Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии РАМН (г. Москва)

РЕЗЮМЕ

Аполипопротеины липопротеидов высокой плотности (ЛВП) удаляет излишки холестерина из клеток путем активного транспорта, что может защищать от атеросклероза. В настоящей работе мы показали, что взаимодействие нагруженных холестерином макрофагов человека с белком переноса фосфолипидов (PLTP) увеличивает связывание ЛВП с клетками и повышает отток холестерина и фосфолипидов через этот путь. PLTP не стимулировал отток липидов в присутствии альбумина, очищенного аполипопротеина A-I и фосфолипидных везикулы, что позволяет предположить наличие специфики для частиц ЛВП. PLTP восстанавливал отток липидов при мягкой трипсинизации ЛВП предположительно за счет генерации активных аполипопротеинов. Стимулированный PLTP отток липидов отсутствовал в макрофагах, взятых у больных болезнью Танжера, при индукции нагрузкой холестерином и  ингибировании брефелдином А, что указывает на селективность эффекта для пути аполипопротеин-опосредованного оттока липидов. Стимулирующий отток липидов эффект PLTP не связан с генерацией преβ частиц ЛВП в растворе, но нуждается во взаимодействии с клетками. Это взаимодействие увеличивает отток холестерина, осуществляемый минорными частицами ЛВП с электрофоретической подвижности между α и преβ. Полученные результаты свидетельствуют о том, что PLTP способствует связыванию ЛВП с клеточной поверхностью и ремоделированию ЛВП с тем, чтобы повысить возможности частиц вызывать отток холестерина и фосфолипидов по аполипопротеин-опосредованному пути, то есть пути, который может играть важную роль в повышении оттока избыточного холестерина из тканей и тормозящего атерогенез.

Ключевые слова: аполипопротеин; атеросклероз; белок переноса фосфолипидов; липопротеиды высокой плотности; отток холестерина; отток фосфолипидов.

1. ВВЕДЕНИЕ

Широко распространено мнение, что липопротеиды высокой плотности (ЛВП) защищают от атеросклероза, удаляя избыток холестерина из клеток для транспортировки их в печени. Проведенные исследования показали, что компоненты ЛВП способствуют оттоку холестерина из клеток, по крайней мере, двумя независимыми путями [1-3]. Во-первых, фосфолипиды ЛВП забирают холестерин, который десорбируется с плазматической мембраны; это пассивный процесс, облегчаемый связыванием ЛВП со скевенджер рецептором B1 [4, 5]. Во-вторых, аполипопротеины ЛВП удаляют как холестерин, так и фосфолипиды из клеток активным, Гольджи-зависимым путем, индуцированным нагрузкой клеток холестерином [6-8]. Этот процесс нарушается в клетках пациентов с болезнью Танжера [9-11], что приводит к тяжелому дефициту ЛВП, накоплению стеринов в тканевых макрофагах и к увеличению распространенности сердечно-сосудистых заболеваний [12,13].
                Аполипопротеин-опосредованной путь удаления холестерина специфичен для аполипопротеинов, которые содержат мало липидов или вообще их не содержат [1,2]. Такие аполипопротеины могут быть генерированы в естественных условиях путем синтеза заново и регенерированы путем диссоциации с поверхности зрелых частиц ЛВП [14]. Минорная фракция плазменного aпо А-I (основного аполипопротеина ЛВП) связана с очень малым количество липидов [3,15]. Таким образом, факторы, которые увеличивают регенерацию аполипопротеинов с низком содержанием липидов из зрелых частиц ЛВП, могут иметь значительное воздействие на мобилизацию избыточного холестерина из тканей. Таким фактором может быть белок переноса фосфолипидов (PLTP). Плазменный PLTP переносит фосфолипиды липопротеидов между частицами и опосредует преобразование ЛВП в более крупные и более мелкие частицы in vitro [16-21]. Это преобразование генерирует частицы с низким содержанием липидов, которые являются активным акцептором клеточного холестерина [19]. Аденовирус-опосредованная оверэкспрессия PLTP в печени мышей заметно снижает ЛВП в крови в связи с повышением удаления липидов ЛВП в печени [22, 23]. Однако экспрессия PLTP человека в тканях апо A-I трансгенных мышей увеличивала плазменные уровни фосфолипидов и холестерина ЛВП [24], а снижение экспрессии генов PLTP у мышей дикого типа заметно снижало уровень ЛВП [25]. Хотя эти эффекты могут быть связаны с изменениями переноса липидов между липопротеидами, изменение оттока из ткани фосфолипидов и холестерина в ЛВП также может играть существенную роль. Такая возможность была подтверждена исследованием, показавшим, что активность PLTP была существенным положительным предиктором способности плазмы крови человека осуществлять отток холестерина из культивируемых клеток [26]. Одним из механизмов, объясняющим такое повышение оттока липидов является то, что апо AI с низким содержанием липидов, генерируемый из ЛВП плазмы под воздействием PLTP, мобилизует отток липидов из клеток.

Другие данные свидетельствуют о том, что локально продуцируемый PLTP может модулировать липидный обмен в периферических тканях. PLTP экспрессируется повсеместно во всех тканях человека и мыши; в легких и органах стероидогенеза имеет место самая высокая экспрессия [27, 28]. PLTP существенно экспрессируется в эпителиальных клетках альвеолярного типа II и индуцируется гипоксией и эмфиземой [29], что позволяет предположить, что этот белок играет важную роль в поверхностном переносе липидов. Экспрессия PLTP человека в периферических тканях трансгенных мышей может изменять метаболизм липопротеидов [24, 30, 31] даже если экспрессия в печени и трансферная активность в плазме не изменяются, что означает, что PLTP периферических тканей обладает важным влиянием  на метаболизм липопротеидов. В настоящей работе мы использовали культивируемые макрофаги  человека для изучения возможность того, что PLTP может непосредственно взаимодействовать с периферическими клетками и способствует удалению клеточных липидов.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. ЛВП, aпо А-I и фосфолипидные везикулы

Фракция частиц ЛВП₃ с плотностью 1,125 - 1,21 г / мл (далее обозначаемые как ЛВП) были получены стандартным последовательным ультрацентрифугированием пулированной свежей плазмы крови человека. Аро В и аро E были удалены колоночной хроматографией на гепарин-агарозе [32]. Aпо А-I был очищен из ЛВП как описано ранее [33]. ЛВП и аро A-I йодировали методом с использованием монохлорида йода по Bilheimer и др. [34]. Трипсинизированные ЛВП (трЛВП) были получены обработкой ЛВП трипсином в течение 15 мин при 37°C при отношении белков ЛВП:трипсин 40:1, а затем вновь выделяли обработанные частицы с помощью колоночной хроматографии. Как описано детально в другой работе [35], эта процедура разрушает примерно 20% от общего белка ЛВП, не нарушая ее липидного состава. Почти все оставшиеся после обработки белки, связанные с трЛВП частицами, были интактными аполипопротеинами [35]. Фосфолипидные везикулы были получены  ультразвуковой обработкой из фосфатидилхолина как описано ранее [36].

2.2. Рекомбинантный PLTP

Рекомбинантный PLTP выделяли хроматографией на колонке смолы Ni-NTA из безсывороточной кондиционированной культуральной среды, собранной при культивировании ВНК-570 клеток, которые были трансфицированы PLTP человека His тегом кДНК с использованием метотрексата как селектирующего агента [17]. Выделенная фракции PLTP были исследована на активность по переносу фосфолипидов в 1:100 разбавленных 10 мкл-аликвотах [36], а на чистоту с помощью SDS полиакриламидного гель-электрофореза (PAGE) по Laemmli [37].

2.3. Клеточные культуры

Макрофаги человека от нормолипидемических доноров и пациента с болезнью Танжере [10] были выращены в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ростовая среда) и посажены для изучения оттока липидов и экспериментов с определением количества холестерина в 16 мм и 35 мм ячейки, соответственно. Для экспериментов с оттоком холестерина, клетки метили путем добавления 0,5 мкCi / мл [³H]холестерина к ростовой среде в течение примерно 72 часов как описано ранее [10]. Клетки затем были нагружены в течение 48 ч немеченым холестерином в концентрации 30 мкг / мл в DMEM, содержащей 2 мг / мл бычьего сывороточного альбумина (БСА). Для измерения оттока холестерина из нерастущих клеток, ненагруженных холестерином, немеченый холестерина не добавлялся в среду без сыворотки. Для измерения оттока холестерина из обедненных стерином клеток, макрофаги инкубировали в течение 48 ч с 10% липопротеид-дефицитной сывороткой, содержащей [³H]холестерин. Чтобы уравнять метку в клеточных пулах, перед каждым экспериментом клетки инкубировали еще 18 - 24 ч в DMEM с 1 мг / мл БСА. Для экспериментов с оттоком фосфолипидов к этой уравновешенной среде были добавлены 20 мкCi / мл [³H]холина хлорида чтобы радиоактивно пометить клеточные фосфолипиды [10]. Кроме того, в некоторых экспериментах клетки предварительно инкубировали с PLTP, добавленным к уравновешенной среде. После удаления уравновешенной среды, клетки промывали три раза PBS-БСА перед инкубацией для измерения оттока.

2.4. Отток холестерина и фосфолипидов

Эффект PLTP на липидный отток из макрофагов человека оценивали по методу, описанному ранее [10, 38]. Вкратце, радиоактивно меченные и нагруженные холестерином клетки инкубировали при 37°C с различными средами для оттока за указанные периоды времени, и среду забирали и центрифугировали для удаления клеточного мусора. Для клеток меченых [³Н]холестерином отток холестерина измеряли путем оценки радиоактивности среды. Для экспериментов с клетками, содержащими меченые фосфолипиды, среду экстрагировали методом Folch [39], и липиды разделяли тонкослойной хроматографии (ТСХ) с использованием силикагелевых пластин разогнанных в гексане, диэтиловом эфире и уксусной кислоте (120:40:1,5, об./об./ об.). Радиоактивность холестерина, эфиров холестерина и общего пятна фосфолипидов были оценена на жидкостном сцинтилляционном счетчике. Промытый слой клеток был экстрагирован смесью гексан:изопропанол, 3:2 по об./об. [32], и липидные экстракты подвергали ТСХ для количественного определения радиоактивности и массы липидов.

2.5. Этерификация холестерин и определение массы

Для оценки скорости относительной этерификации холестерина клетки инкубировали в течение 1 ч с DMEM, содержащей 9 мкM [¹⁴C]олеата, связанного с 3 мкM BSA, и включение из [¹⁴C] олеата в эфиры холестерина измерялось как описано [10,35,38]. Масса эфиров холестерина измерялась ферментативным методом как описано ранее [32].

2.6. Связывание с клетками ЛВП и aпо А-I

                Для измерения прямых эффектов PLTP на связывание ЛВП клетки инкубировали в течение 6 ч при 37°C с ¹²⁵I-ЛВП с PLTP или без него, и клеточная радиоактивность измерялась после промывки клеток два раза ледяным PBS-BSA и два раза PBS, затем клетки растворялись в NaOH. В некоторых случаях промытые макрофаги (растущих в 60 мм чашках) собирали путем соскабливания в ледяной буфер, содержащий ингибиторы протеаз. После низкоскоростного центрифугирования клетки растворяли в SDS-PAGE буфере и аликвоты анализировали на содержание белка [40]. Равные количества белка из солюбилизированных клеток были разделены на 15% SDS-PAGE, и клеточно-связанные йодированные аполипопротеины были идентифицированы авторадиографией. Для экспериментов с предварительной инкубацией с PLTP макрофаги предварительно инкубировали с PLTP или без него, промывали и инкубировали 1 час при 37°C с 5 мкг / мл ¹²⁵I-ЛВП с 200 мкг / мл немеченых ЛВП или с 1 мкг / мл ¹²⁵I-aпо А-I с 100 мкг / мл немеченым aпо А-I. Белок из каждой лунки был разделен на аликвоты для определения количества белка и для гамма-счета. Высокоаффинное связывание ЛВП или aпо А-I представляло разницу в связанной с клетками радиоактивностью в присутствии и отсутствии избыточных немеченых ЛВП или aпо А-I.

2.7. Распределение Apo-I и [³H] холестерина среди ЛВП частиц

Чтобы оценить эффекты PLTP на распределение aпо А-I среди ЛВП частиц, среду, содержащая ЛВП или трЛВП с PLTP инкубировали при 37°C в бесклеточных лунках; аликвоты среды подвергались электрофорезу в 0,5-0,7% агарозном геле (без альбумина) как описано [41], и белки переносили на нитроцеллюлозу и исследовали с козьей антисывороткой к aпо А-I (разведение 1:5000). Взаимодействующие с антителами полосы были визуализированы хемилюминесценцией (ECL, Amersham). Для оценки эффектов PLTP на распределение клеточного холестерина среди ЛВП частиц, холестерин-нагруженные макрофаги были предварительно мечены  50 мкCi / мл [³Н] холестерином, среда, содержащая ЛВП и трЛВП, подвергалась агарозному гель-электрофорезу, и распределение [³Н]холестерина между частицами ЛВП измерялось на высушенных гелях фосфор-изображеним с использованием Packard Cyclone Phosphor system.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ. 

Чтобы изучить возможность того, что PLTP повышает отток холестерина из клеток, мы оценили эффекты рекомбинантного PLTP на отток холестерина из нагруженных холестерином макрофагов в присутствии различных акцепторов липидов. При инкубации клеток в среде, содержащей один альбумин (Рисунок 1А), очень мало меченого холестерина освобождалось из клеток за 24 ч инкубации, и добавление 2 мкг / мл PLTP не влияло на отток холестерина. Очищенный апо A-I стимулировал отток холестерина из клеток зависимо от времени с насыщением после 12 ч; добавление PLTP снова не влияло на эффект (Рисунок 1В). ЛВП также стимулировали отток холестерина из  клеток, но в этом случае добавление PLTP увеличивало отток холестерина во всех временных точках измерения (Рисунок 1С). Эти результаты показывают, что PLTP повышает способность частиц ЛВП, но не обезлипиженного апо A-I, обеспечивать отток холестерина из клеток.

Рисунок 1 - Временная зависимость эффектов PLTP на отток холестерина из нагруженных холестерином макрофагов

Примечания

1 Макрофаги, меченные в течение 72 ч [³Н]холестерином и нагруженные в течение 48 ч 30 мкг / мл холестерином, с последующим уравновешиванием в течение  24 ч, инкубировали с 2 мкг / мл PLTP добавленным к среде, содержащей либо 1 мг /

мл БСА (А), БСА плюс 10 мкг / мл апо A-I (B) или БСА плюс 50

мкг / мл HDL. В указанной временной точке собирали среду, центрифугировали и определяли ³H радиоактивность;  клеточные липиды экстрагировали и разделяли тонкослойной хроматографией, чтобы определить количественно радиоактивность свободного и этерифицированного холестерина.

2 Отток холестерина была рассчитан как появление [³H]холестерина в среде в процентах от общего (клетки + среда) [³H]холестерина.

3 Каждое значение представляет среднее ± S.D. для трех лунок.

Фосфолипиды ЛВП и аполипопротеины удаляют клеточные липиды различными механизмами; оба вносят вклад в ЛВП-опосредованный отток холестерина [1]. Аполипопротеин-опосредованная компонента липидного оттока неактивна в макрофагах больных болезнью Танжера (БТ), тогда как фосфолипид-опосредованной отток холестерина проходит нормально [8, 10, 11]. Кроме того, удаление клеточных фосфолипидов ЛВП частицами опосредовано в основном аполипопротеинами ЛВП [8, 11]. Чтобы определить, какой из этих процессов оттока липидов усиливается под влиянием PLTP, мы сравнили эффекты PLTP на отток холестерина и фосфолипидов из нормальных макрофагов и макрофагов больного болезнью Танжера. Инкубация с одним PLTP в течение 6 ч не влияла на отток ни [³H]холестерина, ни [³H]фосфолипидов из нагруженных холестерином нормальных и БТ макрофагов (Рисунок 2).

Добавление ЛВП в среду увеличивало отток холестерина и фосфолипидов из нормальных клеток, но имело меньшее влияние на отток холестерина (Рисунок 2А) и почти не влияло на отток фосфолипидов из БТ макрофагов (Рисунок 2В), в соответствии с отсутствием аполипопротеин-опосредованной компоненты липидного оттока в БТ клетках. Добавление PLTP в среду с ЛВП вызывало зависимое от дозы насыщающее увеличение оттока, как холестерина, так и фосфолипидов из нормальных клеток, но не имело значимого влияния на отток этих липидов из БТ клеток. Эти результаты показывают, что PLTP увеличивает отток холестерина и фосфолипидов, вызванный аполипопротеинами ЛВП, но не фосфолипидами ЛВП.

Рисунок 2 - Эффект PLTP на отток холестерина (А) и фосфолипидов (B) из нормальных макрофагов (NL) и макрофагов больного болезнью Танжера (TD)

Примечания

1 Меченные [³Н]холестерином и нагруженные холестерином клетки инкубировали  с  [³H]холином в течение 24 ч, чтобы пометить клеточные фосфолипидов, затем инкубировали в течение 6 ч со средой, содержащей БСА (- HDL) или БСА плюс 50 мкг / мл ЛВП (+ HDL), а также указанные концентрации PLTP. Среда и клеточные липиды были выделены с помощью тонкослойной хроматографии и подвергнуты сцинтилляционному счету.

2 Отток холестерина и фосфолипидов выражался в процентах от общей радиоактивности для каждого липида (среда + клетки).

3 Каждое значение представляет среднее ± S.D. для трех лунок.

Один из возможных механизмов, объясняющий эти данные, заключается в том, что  PLTP изменяет частицу ЛВП таким образом, чтобы сделать более доступными для удаления клеточных липидов большее количество аполипопротеинов. Предыдущие исследования показали, что краткосрочная (15 мин) обработка ЛВП трипсином почти полностью блокирует аполипопротеиновую компоненту ЛВП- опосредованного оттока холестерина [8, 10, 35, 42]. Хотя более 80% аполипопротеинов ЛВП остаются интактными после такой мягкой обработки трипсином, они, по-видимому, не способны удалять клеточные липиды [35]. Мы проверили, может ли PLTP восстановить активность трЛВП, возможно, путем большей доступности аполипопротеинов для взаимодействия с клетками. Добавление PLTP к среде, содержащей возрастающие концентрации ЛВП, увеличивало отток, как холестерина, так и фосфолипидов, с наибольшим увеличением при низких концентрациях ЛВП (Рисунок 3). Трипсинизированные ЛВП были менее эффективными, чем нативные ЛВП в осуществлении оттока холестерина и фосфолипидов при равных концентрациях  (Рисунок 3). PLTP увеличил способность трЛВП осуществлять отток  холестерина и фосфолипидов до уровня, сопоставимого с наблюдаемым для ЛВП. На БТ макрофагах, однако, PLTP не имел значимого эффекта на трЛВП-опосредованный отток холестерина и фосфолипидов. Эти результаты согласуются с концепцией, согласно которой PLTP восстанавливает способность трЛВП осуществлять отток липидов по аполипопротеин-опосредованному пути.

Рисунок 3 - Стимулирующее действие PLTP на отток клеточного холестерина и фосфолипидов, опосредованный ЛВП и трЛВП

Примечания

1 Макрофаги были мечены [³Н]холестерином и [³H]холином и нагружены холестерином как описано для Рисунка 2. Затем клетки инкубировали в течение 6 ч с указанной концентрацией ЛВП и трЛВП  с PLTP (10 мкг / мл). Измерялся отток [³H]холестерина (UC) и [³Н]фосфолипидов (PL).

2 Каждое значение представляет среднее ± S.D. для трех лунок.

Обработка трипсином ЛВП практически лишает частицы способности освобождать клетки от избыточного холестерина, подвергаемого этерификации ацил-КоА:холестеринацилтрансферазой (АКАТ) [8,35,42]. Мы проверили, может ли PLTP восстановить эту активность у трЛВП. В условиях, когда ЛВП ингибируют этерификацию холестерина на 60 - 70%, трЛВП обладали лишь небольшим ингибирующим эффектом (Рисунок 4), по-видимому, потому что приток и отток холестерина были сбалансированы. Добавление увеличивающихся концентраций PLTP в среду с трЛВП заметно снижало этерификацию холестерина в зависимости от дозы насыщающим образом, что параллельно увеличивало отток холестерина. Таким образом, PLTP восстанавливал ​​способность трЛВП освобождать клетки от доступного для АКАТ холестерина. Интересно, что добавление одного только PLTP также имело небольшой низкоаффинный эффект на этерификацию холестерина, несмотря на отсутствие эффекта на отток холестерина, из чего можно предположить, что взаимодействие одного PLTP с клетками может в некоторой степени изменить распределение холестерина.

Рисунок 4 –  Действие PLTP на трЛВП-опосредованное уменьшение клеточного холестерина, доступного для этерификации

Примечания

1 Нагруженные холестерином и меченные [³Н]-холестерином макрофаги инкубировали с БСА (контроль) или с БСА плюс трЛВП (40 мкM фосфолипидов) и указанными концентрациями PLTP. После 24 часов, среда была собрана для измерения оттока [³H]холестерина (А), и клетки импульсно-инкубировали 1 ч со средой, содержащей [¹⁴C]олеат для измерения включение олеата в клеточные эфиры холестерина (B) как описано в разделе «Материалы и методы».

2 Каждое значение представляет собой среднее  ± S.D.  трех повторов трех отдельных экспериментов.

Мы сравнили эффекты PLTP на способность обезлипиженного апо A-I, фосфолипидных везикул и трЛВП осуществлять отток холестерина и фосфолипидов и освобождать клетки от эфиров холестерина. Все эти акцепторы липидов стимулировали отток  [³H]холестерина и [³Н]фосфолипидов из нормальных макрофагов (Таблица 1). Хотя PLTP заметно стимулировал опосредованный трЛВП отток, он не обладал эффектом или имел небольшой ингибирующий эффект при добавлении в среду, не содержащую акцепторы aпо А-I или фосфолипидные везикулы. После 24 ч инкубации как апо A-I, так и фосфолипидные везикулы значительно освобождали клетки от эфиров холестерина, в то время как трЛВП не обладали эффектом (Таблица 1). Как и в случае этерификации холестерина, добавление только одного PLTP вызывало небольшое, но значимое снижение содержание эфиров холестерина в клетках. PLTP не вызывал никакого дальнейшего снижения содержания эфиров холестерина при добавлении в среду, содержащую либо aпо А-I, либо фосфолипидные везикулы, но снижал содержание эфиров холестерина на 45% в присутствии трЛВП. Таким образом, PLTP не стимулировал отток липидов или удаление холестерина опосредованное либо обезлипиженным апо A-I, либо безбелковыми фосфолипидами, что предлагает наличие обоих компонентов в акцепторных частицах.

Таблица 1 – Эффект PLTP на отток клеточных липидов и на содержание эфиров холестерина в присутствии различных акцепторов липидов

Примечания

1 Для оценки оттока липидов нагруженные холестерином и радиоактивно меченные нормальные макрофаги инкубировали в течение 6 ч без (контроль) или с 10 мкг / мл PLTP как описано для Рисунка 2.

2 Для оценки количества эфиров холестерина нагруженные холестерином макрофаги инкубировали в течение 24 ч с 5 мкг / мл PLTP; содержание клеточных эфиров холестерина было измерено (в виде эквивалента свободного холестерина) как описано в разделе «Материалы и методы».

3 Инкубационная среда содержала либо только БСА (-) или БСА плюс апо A-I (5 мкг / мл), фосфатидилхолиновые везикулы (ФЛВ, 40 мкM) или трЛВП (40 мкM фосфолипидов).

4 Каждое значение является средним ± S.D. трех (отток) или четырех (количество) повторов.

5 Значимый эффект PLTP (Р <0,05) отмечен звездочками.

Мы проверили, является ли сыворотка и нагрузка макрофагов холестерином, которые индуцируют аполипопротеин-опосредованный путь удаления [8, 42], необходимыми для стимулирующего эффекта PLTP. Когда макрофаги предварительно инкубировали с липопротеид-дефицитной сывороткой, чтобы вызвать отток холестерина, PLTP значимо не способствовал обеспечению повышения трЛВП-опосредованного оттока холестерина (Таблица 2). Когда липопротеид-дефицитная сыворотка обогащалась холестерином, PLTP имел умеренный стимулирующий эффект на отток холестерина. Прединкубация клеток в течение нескольких дней с безсывороточной средой приводила к небольшому росту способности PLTP стимулировать трЛВП-опосредованный отток холестерина, и эффект еще более увеличивался при добавлении холестерина. Таким образом, появление способности у PLTP повышать трЛВП-опосредованный отток холестерина вызывало устранение сыворотки и нагрузки клеток холестерином, что предоставляет дополнительные доказательства того, что это повышение участвует в аполипопротеин-опосредованном пути удаления липидов.

Таблица 2 – Эффект прединкубации на стимулирующее действие PLTP на трЛВП-опосредованный отток холестерина из макрофагов

Примечания

1 Макрофаги были мечены [³Н]холестерином, как описано в разделе «Материалы и методы».

2 Клетки инкубировали в течение 48 ч с 10% липопротеид-дефицитной сывороткой  с холестерином (30 мкг / мл) или без него или в безсывороточной среде, содержащей 1 мг / мл БСА с добавлением или без добавления 30 мкг / мл холестерина. После уравновешивания в течение ночи в среде без сыворотки клетки инкубировали 6 ч в безсывороточной среде с БСА, содержащей трHDL (40 мкМ фосфолипидов) с добавлением или без добавления PLTP (5 мкг / мл), затем измеряли отток [³H]холестерина.

3 Каждое значение представлено средним ± S.D. 6 лунок в двух экспериментах.

Для получения дополнительного подтверждения селективного эффекта PLTP, мы измерили способность брефелдина А ингибировать отток холестерина и фосфолипидов, стимулированный PLTP. Показано, что это агент, разрушающий аппарат Гольджи, препятствует аполипопротеин-опосредованному  пути удаления липидов без воздействия на отток холестерина, которому способствуют фосфолипиды [6, 7, 11].  Инкубация нагруженных холестерином макрофагов с брефелдином А частично ингибировала отток [³H]холестерина и [³H]фосфолипидов как в присутствии, так и в отсутствии PLTP (Таблица 3). Однако инкубация с  брефелдином А ингибирует на приблизительно 60% PLTP-индуцированный отток холестерина и фосфолипидов. Брефелдин А не имел значимого эффекта на трЛВП-опосредованный отток липидов из БТ макрофагов в присутствии PLTP или без него, что свидетельствует о том, что фосфолипид-опосредованная компонента липидного оттока не затрагивается этим агентом. Таким образом, по-видимому, PLTP повышает отток липидов по пути, который, по крайней мере, частично зависит от функционирования аппарата Гольджи.

Таблица 3 – Эффект брефелдина А на индуцируемый PLTP отток липидов из нагруженных холестерином макрофагов

Примечания

1 Нагруженные холестерином макрофаги были мечены [³Н]холестерином и [³H]холином, как описано к Рисунку 2.

2 За 1 ч до инкубации для изучения оттока клетки инкубировали с DMEM / BSA, содержащей растворитель (этанол, 0,1%) или растворитель плюс 4 мкМ брефелдина А. Затем клетки инкубировали в течение 6 ч с DMEM / BSA / этанолом, содержащей трЛВП (40 мкМ фосфолипидов) с добавлением или без добавления PLTP (10 мкг / мл) или брефелдина А, затем измерялся отток [³H]холестерина и [³H]фосфолипидов.

3 Каждое значение представлено средним ± S.D. 3 лунок, представляющих  два эксперимента, имеющие аналогичные результаты.

4 Для PLTP-индуцированных значений, среднее значение для трЛВП был вычтено из значения для трЛВП + PLTP.

5 Числа в скобках указывают процент снижения PLTP-индуцированного оттока липидов в присутствии брефелдина А.

Поскольку PLTP ремоделирует частицы ЛВП и при этом процессе генерируются обедненные липидами аполипопротеины [16-21], мы провели эксперименты, чтобы определить, является ли ремоделирование ЛВП в растворе ответственным за увеличение оттока липидов. При инкубации в течение 2 ч при 37°C в отсутствие клеток, добавление PLTP к среде, содержащей ЛВП, имело небольшой эффект на распределение aпо А-I между α и преβ частицами изолированными с помощью агарозного гель-электрофореза (Рисунок 5). Когда инкубация без клеток была продлена до 6 ч или больше, PLTP заметно увеличивал генерацию преβ aпо А-I. Мы инкубировали ЛВП с PLTP в отсутствие клеток до 12 ч при 37°C, а затем добавили эту среду к клеткам и измеряли отток холестерина в течение 2 ч инкубации. Предварительная обработка ЛВП взаимодействием PLTP не имела большее стимулирующее действия на последующий отток холестерина, чем когда PLTP был добавлен только в течение 2 ч инкубации (Рисунок 5В), несмотря на генерацию, существенно большего количества преβ aпо А-I. Кроме того, предварительная обработка ЛВП взаимодействием с PLTP при 0°С в условиях, когда перенос белка был неактивным, были получены те же результаты, что и при предварительной обработке при 37°C. Мы также обнаружили, что предварительная обработка трЛВП взаимодействием с PLTP до 6 ч в отсутствии клеток не имеет никакого дальнейшего стимулирующего действия на отток холестерина. Эти результаты позволяют предположить либо, что лишь незначительного ремоделирования ЛВП при воздействии PLTP достаточно для получения максимального увеличения оттока холестерина, либо, что для стимулирующего действия PLTP необходимо наличие клеток.

Рисунок 5 – Влияние предварительной инкубации ЛВП с PLTP на ЛВП-опосредованный отток холестерина

Примечания

1 ЛВП (50 мкг / мл) инкубировали в отсутствие клеток без (-) или с (+) PLTP (5 мкг / мл) при 37°C или при 0°C  от 0 ч (неинкубированный маточный раствор при 0°C) до 12 ч.

2 (А) В парных образах был исследован aпо А-I в агарозном геле иммуноблоттинга. Очищенный aпо А-I был использован в качестве маркера для преβ ЛВП (крайняя левая дорожка).

3 (B) Прединкубированные ЛВП затем инкубировали при 37°C с радиоактивно мечеными нагруженными холестерином макрофагами; отток холестерина измеряли через 2 ч.

4 Каждое значение представлено средним ± S.D. 3 повторов.

Для дальнейшего изучения возможности того, что PLTP увеличивает отток холестерина путем генерации в растворе более подходящих акцепторов клеточного холестерина, мы измерили отток [³Н]холестерина на обработанные PLTP и на контрольные ЛВП в течение 2 мин инкубации с нагруженными холестерином макрофагами. Такие краткосрочные инкубации могут выявлять обезлипиженные аполипопротеины, которые являются предпочтительными инициирующими акцепторами клеточного холестерина [3, 19, 43, 44], а также имеют преимущество минимизации PLTP-клеточного взаимодействия как вносящего вклад фактора. ЛВП частицы (50 мкг / мл) обработанные PLTP (10 мкг / мл) в течение 22 ч при 37°C (условия, которые генерируют значительное количество преβ ЛВП), были не более эффективными, чем необработанные частицы ЛВП в осуществлении оттока холестерина в течение 2 мин инкубации с клетками (1469±120 против 1487±166 cpm [³H]холестерина / на лунку, n = 4). Таким образом, в условиях эксперимента преβ частицы ЛВП, генерируемые PLTP в растворе, не являются лучшим инициирующим акцептором клеточного холестерина по сравнению с основной частью α-мигрирующих ЛВП частиц. Эти результаты подразумевают причастность клеточного взаимодействия к стимулирующему эффекту PLTP на ЛВП-опосредованный отток холестерина.
                Для получения прямого доказательства потребности клеток в эффектах PLTP, мы предварительно инкубировали нормальные и БТ макрофаги в течение 4 ч в среде,  содержащей PLTP, и затем измеряли уровень оттока холестерина в течение последующих 2 ч инкубации в отсутствие PLTP. Предварительная инкубация клеток с PLTP не влияла значимо на последующий отток холестерина в отсутствие акцепторов или в присутствии apo-I (Рисунок 6). Однако в присутствии ЛВП или трЛВП предварительная инкубация клеток с PLTP значительно увеличивала отток холестерина из нормальных клеток, но не из БТ клеток. Концентрационные кривые для эффектов PLTP на ЛВП-опосредованный отток холестерина были криволинейными (Рисунок 6) с насыщающими участками связывания на клеточной поверхности. Эти результаты показывают, что стимулирующий эффект PLTP на ЛВП-опосредованный отток холестерина осуществляется в результате взаимодействия PLTP с местами связывания клеточной поверхности.

Рисунок 6 – Влияние на отток холестерина инкубации с PLTP нормальных (А) и БТ макрофагов (B)

Примечания

1 Меченные [³Н]холестерином и нагруженные холестерином макрофаги инкубировали с БСА в среде, не содержащей PLTP (белые столбики) или содержащей 10 мкг / мл PLTP (черные столбики). Через 4 ч инкубации при 37°С среду удаляли и промытые клетки инкубировали в среде, содержащей БСА (контроль) или БСА плюс ЛВП (40 мкM фосфолипидов), трЛВП (40 мкM фосфолипидов) или aпо А-I (5 мкг / мл). Через 2 ч при 37°C был измерен отток [³H]холестерина.

2 В отдельном эксперименте (вставка), клетки предварительно инкубировали в течение 4 ч с PLTP до 2 ч инкубации с БСА (белые точки) или БСА плюс ЛВП (черные точки).

2 Каждое значение представлено средним ± S.D. 3 повторов.

3 Значимые эффекты (р<0,002) PLTP в присутствии различных акцепторов указаны звездочками.

Еще одним доказательством участия клеточных взаимодействий стали результаты исследования, показывающего, что добавление PLTP непосредственно к среде, содержащей ¹²⁵I-ЛВП, заметно увеличило связывание ЛВП с клетками (Рисунок 7). Это имело место как для нормальных, так и для БТ макрофагов, что указывает но то, что увеличение связывания само по себе не отвечает за увеличение оттока холестерина. Электрофоретический анализ клеток с помощью SDS-PAGE показал, что PLTP увеличивает связывание с клетками апо A-I и апо А-II в равной степени (Рисунок 7Б), то есть PLTP содействует взаимодействию частиц ЛВП, содержащих оба указанных аполипопротеина, а не только фракцию, обогащенную aпо А-I. Предварительная инкубация клеток с PLTP также увеличивала последующее связывание ЛВП. Высокоаффинное связывание ¹²⁵I-ЛВП (при 5 мкг / мл) после 1 ч инкубации в отсутствие PLTP увеличивалось с 60±3 до 104±2 нг / мг белка (mean±S.D., n = 3), когда PLTP был добавлен в среду во время 24 ч прединкубации. В отличие от предварительной инкубации  клеток с PLTP не было значимого эффекта на ¹²⁵I-апо AI связывания с клетками. Эти данные указывают на то, что прямое взаимодействие PLTP с клетками способствует последующему связыванию ЛВП.

Рисунок 7 - Влияние PLTP на связывание ЛВП с нормальными и БТ макрофагами

Примечания

1 (А) Нагруженные холестерином макрофаги инкубировали в среде, содержащей БСА плюс указанные концентрации ¹²⁵I-ЛВП и 10 мкг / мл

PLTP. После 6 часов инкубации клетки промывали и анализировали связанную с клетками ¹²⁵I-радиоактивность как описано в разделе «Материалы и методы».

2 Каждое значение представлено средним ± S.D. 3 повторов.

3 (B) Парные чашки с нагруженными холестерином нормальными макрофагами инкубировали со средой, содержащей 50 мкг / мл ¹²⁵I-ЛПВП с 10 мкг / мл PLTP в течение 6 ч. Равные количества (133 мкг) клеточного белка из каждой чашки были разделены SDS-PAGE; йодированные аполипопротеины идентифицировали авторадиографией.

Наконец, мы рассмотрели, может ли ремоделирование ЛВП под воздействием PLTP в присутствии клеток объяснить увеличение оттока холестерина. Для этих исследований мы подвергали аликвоты среды электрофорезу в агарозном геле и измеряется распределение [³Н]холестерина между частицами ЛВП. Когда PLTP был добавлен к среде, содержащей ЛВП в течение 6 ч инкубации с клетками, наблюдалось некоторое увеличение [³H]холестерина, освобожденного из клеток, связанного с основными α-мигрирующими частицами ЛВП, но наибольшее относительное увеличение происходило в частицах, мигрирующих между α и преβ частицами (Рисунок 8, стрелка). Через 6 ч инкубации с одними только трЛВП большая часть [³Н]холестерина, высвобождаемого из клеток, была связана с полосой, которая мигрировала между α и преβ частицами (Рисунок 8А). Когда PLTP был добавлен в среду с трЛВП, появилась дополнительная полоса [³Н]-меченого холестерина, которая имела преβ подвижность (стрелка). Мы также обнаружили, что предварительная инкубация клеток с PLTP увеличивала ассоциацию [³Н]холестерина с частицами ЛВП и трЛВП с более низким электроотрицательным зарядом в течение последующих 2 ч инкубации без PLTP (Рисунок 8В, стрелки), хотя изменения были более умеренные, чем те, которые наблюдались при инкубировании липопротеидов и PLTP одновременно. Эти результаты указывают на то, что холестерин, высвобождаемый из клеток в ответ на воздействие PLTP селективно связывается с минорными частицами ЛВП с электроотрицательным зарядом более низким, чем у  α-мигрирующих ЛВП.

Рисунок 8 - Влияние PLTP на распределение клеточного [³Н]холестерина между ЛВП частицами

Примечания

1 Меченные [³Н]холестерином и нагруженные холестерином макрофаги инкубировали в течение 6 ч со средой, содержащей ЛВП (40 мкM фосфолипидов) или трЛВП (40 мкM фосфолипидов) минус или плюс 5 мкг / мл PLTP (А, одновременно) или предварительно инкубировали в течение 20 ч без или с PLTP, а затем инкубировали в течение 2 ч с ЛВП или трЛВП в отсутствие PLTP (B, предварительная обработка). Аликвоты среды из парных лунок подвергали электрофорезу в агарозном геле; распределение [³H]холестерина выявлялось фосфор-изображением.

2 Положение α и преβ частиц было определено по окрашиванию белка параллельных полос, содержащих ЛВП и очищенный  apo-I, соответственно.

4. ОБСУЖДЕНИЕ

                Фосфолипиды и аполипопротеины ЛВП содействуют оттоку холестерина из нагруженных холестерином клеток, используя различные механизмы [1, 2, 8]. В нашей работе приведены доказательства того, что PLTP избирательно усиливает аполипопротеиновую компоненту ЛВП-опосредованного оттока липидов. Рекомбинантный PLTP увеличивает способность ЛВП осуществлять отток как холестерина, так и фосфолипидов их нагруженных холестерином макрофагов. При этом PLTP не влиял на ЛВП-опосредованный отток липидов из БТ макрофагов, клеток с неактивным аполипопротеин-опосредованным оттоком липидов, но с нормальным уровнем оттока холестерина на фосфолипиды [8, 10, 11]. Самым поразительным было стимулирующее действие PLTP в присутствии трЛВП, частицы, которые, как было показано, теряли большую часть своей аполипопротеин-опосредованной активности по удалению липидов [8, 10, 35, 42]. Мягкая трипсинизация затрагивает только 15 - 20% аполипопротеинов ЛВП, но они, по всей видимости, отвечают за активные пути удаление липидов, которые  дефектны в БТ клетках [8, 10]. Наши данные позволяют предположить, что PLTP восстанавливает способность трЛВП удалять клеточные липиды по этому пути.
                Существует несколько других линий доказательств, поддерживающих заключение о том, что PLTP избирательно усиливает аполипопротеин-опосредованную компоненту оттока липидов. Во-первых, PLTP может восстановить способность трЛВП освобождать макрофаги от избыточного холестерина, способного этерифицироваться под воздействием АКАТ, процесс, который во многом зависит от активного аполипопротеин-опосредованного пути удаления липидов [7, 8, 10, 35, 38, 42]. Во-вторых, стимулирующее действие PLTP было вызвано удалением сыворотки и нагрузки макрофагов холестерином, то есть созданием условий, которые избирательно повышают скорость аполипопротеин-опосредованного оттока липидов [8, 42]. В-третьих, PLTP-стимулированный отток холестерина и фосфолипидов снижался при воздействии на клетки брефелдина А, агента, который разрушает комплекс Гольджи и тем самым подавляет аполипопротеин-опосредованный отток липидов, но не влияет на отток холестерина, вызванный фосфолипидами [6, 7, 11]. Взятые вместе, эти данные указывают на то, что PLTP увеличивает способность ЛВП удалять холестерин и фосфолипиды благодаря индуцированному холестерином, чувствительному к  брефелдину А процессу, который, как показано, характерен для оттока липидов, стимулированного обезлипиженными аполипопротеинами.

                По-видимому, PLTP стимулирует аполипопротеиновую компоненту ЛВП-опосредованного оттока липидов путем создания более пригодного субстрата  для этого процесса, а не путем непосредственно повышение активности клеточного пути. Аполипопротеин-опосредованный отток липидов специфичен для обмениваемых аполипопротеинов, которые содержат мало липидов или не содержат вовсе [1-3, 8, 10, 11]. В экспериментах на культуре клеток обезлипиженный апо A-I может быть получен из ЛВП частиц благодаря диссоциации с поверхности частицы [1, 2, 35]. Мягкая трипсинизация этих частиц, вероятно, разрушает наиболее легко диссоциируемые пулы апо A-I [35], осуществляя, таким образом, селективное ингибирование аполипопротеиновой компоненты ЛВП-опосредованного оттока липидов [8, 10, 35]. PLTP не стимулирует липидный отток в присутствии очищенного апо AI, что указывает на то, что он не эффективен, когда обезлипиженные аполипопротеины уже доступны. Таким образом, вполне вероятно, что PLTP улучшает способность ЛВП и трЛВП удалять клеточные липиды либо увеличением доли недиссоциируемых аполипопротеинов, либо непосредственно генерируя обезлипиженные аполипопротеины.

                Сообщалось, что взаимодействие плазмы с PLTP приводит к образованию большего числа преβ1 апо A-I, являющихся предпочтительных акцептором клеточного холестерина [3, 43, 44], а также увеличивает способность плазмы содействовать оттоку клеточного холестерина [19]. Мы обнаружили, однако, что взаимодействие ЛВП с PLTP до инкубации с клетками, которое производит больше преβ ЛВП частиц, не улучшает способности ЛВП содействовать оттоку клеточного холестерина. Различия в условиях экспериментах может объяснить, почему наши данные, по всей видимости, находятся в противоречии с предыдущими исследованиями. В качестве источников преβ ЛВП и клеточного холестерина, мы использовали изолированные ЛВП₃ и лишенные сыворотки нагруженные холестерином макрофаги, тогда как другие исследователи использовали цельную плазму и инкубировали макрофаги в присутствии сыворотки. В наших условиях частицы ЛВП, содержащие генерируемые PLTP преβ aпо А-I, не были лучшим акцептором клеточного холестерина, чем ЛВП, которым не хватало преβ aпо А-I. Таким образом, стимулирующий эффект PLTP на ЛВП-опосредованной отток холестерина не сопровождается генерацией преβ aпо А-I частиц в растворе.

Одним из объяснений этих результатов может быть то, что для стимулирующего эффекта на ЛВП-опосредованный отток липидов необходимо взаимодействие PLTP с клетками. Эти представления подтверждаются результатами, показывающими, что предварительная инкубация клеток с PLTP усиливает ЛВП-опосредованный отток холестерина при последующей инкубации и в отсутствие PLTP. Стимулирующий эффект PLTP демонстрирует аналогичную насыщаемость, инкубируются ли клетки последовательно или одновременно с PLTP и ЛВП. PLTP также увеличил связывание ЛВП с клетками, и этот эффект наблюдался при предварительной инкубации PLTP с клетки и последующей инкубацией с мечеными ЛВП. Таким образом, PLTP взаимодействующий с клетками, а не с ЛВП частицами в растворе, оказалась ответственным как за увеличение ЛВП-опосредованный отток холестерина, так и за повышение связывания ЛВП.

                Несколько возможных механизмов могут объяснить участие PLTP во взаимодействии с клетками, в стимулировании оттока холестерина и связывании ЛВП. Во-первых, PLTP может нарушать  липидные домены плазматической мембраны, чтобы повысить связывание ЛВП и сделать липиды более доступными  для удаления частицами ЛВП. Мы установили, что длительная инкубация клеток с PLTP умеренно ингибирует этерификацию холестерина даже в том случае, когда она явно не способствовала оттоку холестерина, что позволяет предположить, что взаимодействие PLTP с плазматической мембраной вызывает определенное перераспределение клеточного холестерина. Этот механизм представляется маловероятным, однако, поскольку инкубация с PLTP не влияет на отток холестерина и фосфолипидов, стимулированный либо обезлипиженным апо A-I, либо фосфолипидными везикулами, это является указанием на специфичность частиц ЛВП, содержащих как аполипопротеины, так и липиды. В качестве второго механизма может служить взаимодействие PLTP с клетками, которое может способствовать последующему связыванию частиц ЛВП с поверхностью клетки и облегчать прямой перенос липидов плазматической мембраны на частицы ЛВП. Это взаимодействие, тем не менее, нуждается в специфичной активации аполипопротеиновой компоненты ЛВП-опосредованного оттока липидов, так как PLTP увеличивает связывание ЛВП с БТ клетками, несмотря на отсутствие возможности для повышения оттока липидов.

                Наиболее вероятное объяснение полученных результатов заключается в том, что PLTP взаимодействует с клетками и способствует последующему связыванию ЛВП и ремоделированию на клеточной поверхности. Это ремоделирование может генерировать обедненные липидами аполипопротеины, которые имеют прямой доступ к сайтам связывания или к рецепторам, участвующим в оттоке клеточных липидов по пути активного транспорта. Поскольку этот путь неактивен в БТ клетках, PLTP не в состоянии стимулировать отток липидов из этих клеток, несмотря на повышение связывания ЛВП и ремоделирования. Эта модель подтверждается результатами, демонстрирующими, что холестерин, выходящий из клеток в ответ на PLTP, избирательно ассоциируется с ЛВП частицами, имеющими электрофоретическую мобильность между α и преβ частицами. Эти частицы могут представлять собой обедненные липидами аполипопротеины, генерируемые из ЛВП, которые насытились клеточными липидами, как это было описано ранее [45]. Связывание с поверхностью клетки и ремоделирование ЛВП могло бы быть эффективным механизмом мобилизации избытка холестерина из клеток и регенерации насцентных частиц из зрелых ЛВП.

                Хотя было установлено, что PLTP функционирует, обеспечивая транспорт фосфолипидов между частицами липопротеидов в плазме, ряд других данных позволяют предположить, что эта белок-переносчик может играть прямую роль в транспортировке липидов из клеток [19, 24, 26, 29]. Наше исследование показало, что PLTP способствует взаимодействию ЛВП с нагруженными холестерином клетками и увеличивает способность аполипопротеинов ЛВП удалять клеточный холестерин и фосфолипиды. Этот процесс может увеличить выведение избыточного холестерина и других липидов из тканей в организме и защищать от атеросклероза.

Работа поддержана Министерством образования и науки Российской Федерации.

ЛИТЕРАТУРА

1 Oram J.F., Yokoyama S. Apolipoprotein-mediated removal of cellular cholesterol and phospholipids.  // J. Lipid. Res. - 1996. - Vol. 37. - P. 2473-2491.

2 Yokoyama S. Apolipoprotein-mediated cellular cholesterol efflux. // Biochim. Biophys. Acta. - 1998. - Vol. 1392. - P. 1-15.

3 Fielding, C.J., Fielding, P.E. Molecular physiology of reverse cholesterol transport. // J. Lipid. Res. - 1995. - Vol. 36. - P. 211-228.

4 Ji ,Y., Jian, B., Wang, N., et al. Scavenger receptor BI promotes high density lipoprotein-mediated cellular cholesterol efflux. // J. Biol. Chem. - 1997. - Vol. 272. - P. 20982-20985.

5 Jian, B., de la Llera-Moya, M., Ji, Y., et al. Scavenger receptor class B type I as a mediator of cellular cholesterol efflux to lipoproteins and phospholipid acceptors. // J. Biol. Chem. - 1998. - Vol. 273. - P. 5599-5606.

6 Mendez, A.J. Monensin and brefeldin A inhibit high density lipoprotein-mediated cholesterol efflux from cholesterol-enriched cells. Implications for intracellular cholesterol transport. // J. Biol. Chem. - 1995. - Vol. 270. - P. 5891-5900.

7 Mendez ,A.J,, Uint, L. Apolipoprotein-mediated cellular cholesterol and phospholipid efflux depend on a functional Golgi apparatus. // J. Lipid. Res. - 1996. - Vol. 37. - P. 2510-2524.

8 Mendez, A.J. Cholesterol efflux mediated by apolipoproteins is an active cellular process distinct from efflux mediated by passive diffusion. // J. Lipid. Res. 1997. - Vol. 38. - P. 1807-1821.

9 Walter, M., Gerdes, U., Seedorf, U., Assmann, G. The high density lipoprotein- and apolipoprotein A-I-induced mobilization of cellular cholesterol is impaired in fibroblasts from Tangier disease subjects. // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1994. - Vol. 205. - P. 850-856.

10 Francis, G.A., Knopp, R.H., Oram, J.F. Defective removal of cellular cholesterol and phospholipids by apolipoprotein A-I in Tangier Disease. // J. Clin. Invest. - 1995. - Vol. 96. - P. 78-87.

11 Remaley, A.T., Schumacher, U.K., Stonik, J.A., et al. Decreased reverse cholesterol transport from Tangier disease fibroblasts. Acceptor specificity and effect of brefeldin on lipid efflux. // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 1997. - Vol. 17. - P. 1813-1821.

12 Assmann G.A., von Eckardstein A., Brewer H.B., in: C.R. Scriver, A.L. Beaudet, W.S. Sly, D. Valle (Eds.) // The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease, McGraw-Hill, New York.1995. - P. 2053-2072.

13 Serfaty-Lacrosniere, C., Civeira, F., Lanzberg, A., et al. Homozygous Tangier disease and cardiovascular disease. // Atherosclerosis. - 1994. - Vol. 107. - P. 85-98.

14 Clay, M.A., Newnham, H.H., Forte, T.M., Barter, P.I. Cholesteryl ester transfer protein and hepatic lipase activity promote shedding of apo A-I from HDL and subsequent formation of discoidal HDL. // Biochim. Biophys. Acta. - 1992. - Vol. 1124. - P. 52-58.

15 Asztalos, B.F., Roheim, P.S. Presence and formation of 'free apolipoprotein A-I-like' particles in human plasma. // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 1995. - Vol. 15. - P. 1419-1423.

16 Tu, A.Y., Nishida, H.I., Nishida, T. High density lipoprotein conversion mediated by human plasma phospholipid transfer protein. // J. Biol. Chem. - 1993. - Vol. 268. - P. 23098-23105.

17 Albers, J.J., Wolfbauer, G., Cheung, M.C., et al. Functional expression of human and mouse plasma phospholipid transfer protein: effect of recombinant and plasma PLTP on HDL subspecies. // Biochim. Biophys. Acta. - 1995. - Vol. 1258. - P. 27-34.

18 Lusa, S., Jauhiainen, M., Metso, J., et al. The mechanism of human plasma phospholipid transfer protein-induced enlargement of high-density lipoprotein particles: evidence for particle fusion. // Biochem. J. - 1996. - Vol. 313. - P. 275-282.

19 von Eckardstein, A., Jauhiainen, M., Huang, Y., et al. Phospholipid transfer protein mediated conversion of high density lipoproteins generates pre beta 1-HDL. // Biochim. Biophys. Acta. - 1996. - Vol. 1301. - P. 255-262.

20 Pussinen, P.J., Jauhiainen, M., Ehnholm, C. ApoA-II/apoA-I molar ratio in the HDL particle influences phospholipid transfer protein-mediated HDL interconversion. // J. Lipid. Res. - 1997. - Vol. 38. - P. 12-21.

21 Marques-Vidal, P., Jauhiainen, M., Metso, J., Ehnholm, C. Transformation of high density lipoprotein 2 particles by hepatic lipase and phospholipid transfer protein. // Atherosclerosis. - 1997. - Vol. 133. - P. 87-95.

22 Föger, B., Santamarina-Fojo, S., Shamburek, R.D., et al. Plasma phospholipid transfer protein. Adenovirus-mediated overexpression in mice leads to decreased plasma high density lipoprotein (HDL) and enhanced hepatic uptake of phospholipids and cholesteryl esters from HDL. // J. Biol. Chem. - 1997. - Vol. 272. - P. 27393-27400.

23 Ehnholm, S., van Dijk, K.W., van 't Hof , B., et al. Adenovirus mediated overexpression of human phospholipid transfer protein alters plasma HDL levels in mice. // J. Lipid. Res. - 1998. - Vol. 39. - P. 1248-1253.

24 Jiang, X., Francone, O.L., Bruce, C., et al. Increased prebeta-high density lipoprotein, apolipoprotein AI, and phospholipid in mice expressing the human phospholipid transfer protein and human apolipoprotein AI transgenes. // J. Clin. Invest. - 1996. - Vol. 98. - P. 2373-2380.

25 Jiang, X.C., Bruce, C., Mar, J., et al. Targeted mutation of plasma phospholipid transfer protein gene markedly reduces high-density lipoprotein levels. // J. Clin. Invest. - 1999. - Vol. 103. - P. 907-914.

26 Syvänne, M., Castro, G., Dengremont, C., et al. Cholesterol efflux from Fu5AH hepatoma cells induced by plasma of subjects with or without coronary artery disease and non-insulin-dependent diabetes: importance of LpA-I:A-II particles and phospholipid transfer protein.  // Atherosclerosis. - 1996. - Vol. 127. - P. 245-253.

27 Day, J.R., Albers, J.J., Lofton-Day, C.E., et al. Complete cDNA encoding human phospholipid  transfer protein from human endothelial cells. // J. Biol. Chem. - 1994. - Vol. 269. - P. 9388-9391.

28 Jiang, X.C., Bruce, C. Regulation of murine plasma phospholipid transfer protein activity and mRNA levels by lipopolysaccharide and high cholesterol diet.  // J. Biol. Chem. - 1995. - Vol. 270. - P. 17133-17138.

29 Jiang, X.C., D'Armiento, J., Mallampalli, R.K., et al. Expression of plasma phospholipid transfer protein mRNA in normal and emphysematous lungs and regulation by hypoxia.  // J. Biol. Chem. - 1998. - Vol. 273. - P. 15714-15718.

30 Albers, J.J., Tu, A.Y., Paigen, B., et al. Transgenic mice expressing human phospholipid transfer protein have increased HDL/non-HDL cholesterol ratio. // Int. J. Clin. Lab. Res. - 1996. - Vol. 26. - P. 262-267.

31 Tu, A.Y., Paigen, B., Wolfbauer, G., et al. Introduction of the human PLTP transgene suppresses the atherogenic diet-induced  increase in plasma phospholipid transfer activity in C57BL/6 mice. // Int. J. Clin. Lab. Res. - 1999. - Vol. 29. - P. 14-21.

32 Oram, J.F. Receptor-mediated transport of cholesterol between cultured cells and high-density lipoproteins. // Meth. Enzymol. - 1986. - Vol. 129. - P. 645-659.

33 Mendez, A.J., Oram, J.F., Bierman, E.L. Protein kinase C as a mediator of high density lipoprotein receptor-dependent efflux of intracellular cholesterol. // J. Biol. Chem. - 1991. - Vol. 266. - P. 10104-10111.

34 Bilheimer, D.W., Eisenberg, S., Levy, R.I. The metabolism of very low density lipoprotein proteins. I. Preliminary in vitro and in vivo observations. // Biochim. Biophys.Acta. - 1972. - Vol. 260. - P. 212-221.

35 Mendez, A.J., Oram, J.F. Limited proteolysis of high density lipoprotein abolishes its interaction with cell-surface binding sites that promote cholesterol efflux. // Biochim. Biophys. Acta. - 1997. - Vol. 1346. - P. 285-299.

36 Cheung, M.C., Wolfbauer, G., Albers, J.J. Plasma phospholipid mass transfer rate: relationship to plasma phospholipid and cholesteryl ester transfer activities and lipid parameters. // Biochim. Biophys. Acta. - 1996. - Vol. 1303. - P. 103-110.

37 Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // Nature. - 1970. - Vol. 227. - P. 680-685.

38 Mendez, A.J., Anantharamaiah, G.M., Segrest, J.P., Oram, J.F. Synthetic amphipathic helical peptides that mimic apolipoprotein A-I in clearing cellular cholesterol. // J. Clin. Invest. - 1994. - Vol. 94. - P. 1698-1705.

39 Folch, J., Lees, M., Sloane-Stanley, G.H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. // J. Biol. Chem. - 1957. - Vol. 226. - P. 497-509.

40 Lowry, O.H., Rosebrough ,N.J., Farr, A.L., Randall, R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. // J. Biol. Chem. - 1951. - Vol. 193. - P. 265-275.

41 O'Kane, M.J., Wisdom, G.B., McEneny, J., et al. Pre-beta high-density lipoprotein determined by immunoblotting with chemiluminescent detection. // Clin. Chem. - 1992. - Vol. 38. - P. 2273-2277.

42 Oram, J.F., Mendez, A.J., Slotte, J.P., Johnson, T.F. High density lipoprotein apolipoproteins mediate removal of sterol from intracellular pools but not from plasma membranes of cholesterol-loaded fibroblasts. // Arterioscler. Thromb. - 1991. - Vol. 11. - P. 403-414.

43 Castro, G.R., Fielding, C.J. Early incorporation of cell-derived cholesterol into pre-beta-migrating high-density lipoprotein. // Biochemistry. - 1988. - Vol. 27. - P. 25-29.

44 von Eckardstein, A., Huang, Y., Wu, S., et al. Reverse cholesterol transport in plasma of patients with different forms of familial HDL deficiency. // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 1995. - Vol. 15. - P. 691-703.

45 Hara, H., Yokoyama, S. Interaction of free apolipoproteins with macrophages. Formation of high density lipoprotein-like lipoproteins and reduction of cellular cholesterol. // J. Biol. Chem. - 1991. - Vol. 266. - P. 3080-3086.