Харьковский Биотехнологический Центр Украинской Академии Аграрных Наук

В обзоре рассмотрены основные направления применения в медицинских исследованиях технологий, основанных на использовании эмбриональных стволовых клеток. К таким технологиям относятся генетические манипуляции с недифференцированными эмбриональными стволовыми клетками, создание химерных животных и  дифференциация эмбриональных стволовых клеток в различные клеточные типы в целях трансплантации.

В последнее время происходит все более интенсивное внедрение биотехнологических методов в медицинские исследования. Одним из широко обсуждаемых  приемов является применение в медицинской практике ЭСК-технологий. В данном обзоре рассматриваются проблемы и перспективы использования эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) в медицине, как в прикладном, так и в фундаментальном аспекте.
ЭСК – это плюрипотентные клетки, выделенные из клеток внутриклеточной массы эмбрионов на стадии бластоцисты[1, 2]. На сегодняшний день получены линии ЭСК мышей, кроликов, хомяка, норки, овец, крупного рогатого скота, приматов и человека[1, 3, 4 ]. Однако, большинство исследований проводятся на мышиных ЭСК, так как они наиболее изучены и являются  удобным модельным объектом. Исследователей привлекает  их способность к дифференциации как in vivo, так и in vitro.
В настоящее время существует два основных направления в научных исследованиях, связанных с применением ЭСК-технологий в медицине: 1) использование недифференцированных ЭСК для генетических манипуляций и создания химерных животных и 2) работы по дифференциации ЭСК в различные типы клеток в целях трансплантации.
При длительном культивировании in vitro ЭСК сохраняют свои фундаментальные характеристики, что позволяет их модифицировать методами генной инженерии без нарушения плюрипотентности. Модификация ЭСК проводится либо трансфекцией вектором, содержащим трансген, либо при помощи направленного нарушения – нокаута – гена[5].
В первом случае проводят трансфекцию специфического хромосомного сайта вектором, несущим необходимый трансген, с последующим культивированием модифицированных клеток. Затем трансфицированные клетки идентифицируют методом позитивно-негативной селекции или при помощи ПЦР. Популяцию трансфицированных клеток вновь культивируют и инъецируют  в бластоцисты, которые потом вводят в матки суррогатных матерей. После чего мышат, у которых генетически модифицированные ЭСК участвовали в образовании клеток зародышевой линии, скрещивают с особями той же линии, а затем скрещивают   их трансгенных потомков. В результате получают трансгенных мышей, гомозиготных по трансгену.
Во втором случае определенный сайт можно направленно разрушить интеграцией с его кодирующей областью специфической последовательности (обычно селективного маркерного гена). Данный метод позволяет исследовать влияние делеции определенного гена на развитие организма и протекающие в нем физиологические процессы. Так, для ЭСК мышей был разработан метод двойного нокаута – выключение аллельной пары генов[5, 6]. Модифицированные таким образом ЭСК объединяют с клетками нормальных преимплантационных зародышей с образованием развивающейся химеры. Работы в этой области имеют большое значение в исследованиях, направленных на изучение проблем гаструляции и органогенеза.
К настоящему времени создано более 250 линий мышей с «нокаутированными» генами, моделирующими различные заболевания человека. Например, при помощи «нокаутированных» мышей созданы модели таких заболеваний, как пигментный ретинит, дистрофия Дюшенна, телангэктазия, болезни обмена веществ и т.п.[5, 6]. Таким образом, большой прорыв в технике создания  трансгенных и химерных животных при помощи ЭСК-технологий позволяет точно моделировать клинические, морфологические и физиологические симптомы различных генетических заболеваний человека.
С развитием трансгенеза и ЭСК-технологий стало возможным создание трансгенных животных в целях ксенотрансплантации[7]. Видом, выбранным для данного типа исследований, стали свиньи ввиду их близкого сходства с человеком по физиологическим свойствам и маленькой стоимости по сравнению с приматами. Однако, несмотря на огромные возможности этой технологии, прогресс в данной области идет медленно. Проблема заключается в наличии у приматов и человека гиперострого имунного ответа, увеличивающегося при трансплантации свиных органов. При этом происходит активация комплемента и быстрое разрушение  трансплантируемого органа. Для решения данной проблемы были созданы свиньи,  производящие комплемент-регуляторные белки. В результате выживаемость органа повышалась, но блок иммунного ответа являлся частичным и орган также разрушался.
Новой сферой медицинских исследований являются технологии трансплантации клеток, основанные на способности ЭСК к спонтанной и направленной дифференцировке in vitro во все клеточные типы взрослого организма: кардиомиоциты, нейроны, клетки крови, клетки кожи, мышечные клетки, гепатоциты и т.д. [6]. Выращивая  стволовые клетки в культуре, генетически их модифицируя, а затем дифференцируя в необходимый тип клеток с последующей имплантацией в организм животного и человека, можно решить проблему донорских органов и тканей. Кроме того, преимуществом трансплантации эмбриональных клеток является слабая экспрессия генов главного комплекса гистосовместимости данных клеток. Это позволяет решить одно из серъезных затруднений, возникающих  при пересадке специализированных клеток взрослых доноров, - проблема отторжения чужеродной ткани реципиентом.
Несмотря на явные преимущества использования ЭСК-технологий, вопрос их применения относится к так называемым биоэтическим проблемам. В ряде стран (США, Франция, Италия, Германия) за счет ограничения государственного финансирования наложен мораторий на исследования ЭСК в государственных лабораториях. В США National Institutes of Health (NIH) одобрил только 64  имеющиеся клеточные линии («жертвенный список»)[8], из которых 20 получены в США, и 7 из 20 - в государственных лабораториях.. Однако, большая часть клеточных линий (24) принадлежит коммерческим компаниям, которые продолжают исследования в области ЭСК, расширяя имеющуюся научную базу. Исследования также продолжаются в Швеции,  Австралии,  Индии,  Израиле, Канаде и Сингапуре.
В настоящее время в США и некоторых странах Европы уже используются новейшие технологии по трансплантации клеток для лечения иммунодефицитных состояний, нарушений гемопоэза, заболеваний печени, мышечных дистрофий, дегенеративных изменений  нервной ткани, репродуктивной системы, костной, хрящевой и покровных тканей[9, 10].
Таким образом, разработка и внедрение биотехнологических методов, основанных на использовании ЭСК, открывает многообещающие перспективы для медицинских исследований в сфере изучения механизмов, моделирования и коррекции заболеваний, ранее считавшихся неизлечимыми.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.    Дыбан А.П. Раннее развитие млекопитающих // Л.: Наука. - 1988. - 228с.
2.    Мануилова Е.С., Гордеева О.Ф., Гривенников И.А., Озернюк Н.Д. Эмбриональные стволовые клетки: спонтанная и направленная дифференцировка // Известия АН. Сер. Биологическая. – 2001.- № 6. – С. 704 – 710.
3.    Савченкова И.П, Фляйшманн З.М., Булла Й., Брем Г. Использование плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток мыши для получения химерных животных // Цитология, - 1994. - Т.38. - № 10. - С. 1118-1123.
4.    Эрнст Л.К. Сергеев Н.И. Трансплантация эмбрионов сельско-хозяйственных животных. - М.: Агропромиздат, - 1989.
5.    Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение // Пер. с англ. – М.: Мир, - 2002. – 589 с., ил. 
6.    Репин В.С. Эмбриональная стволовая клетка ( от фундаментальной биологии к медицине) // Успехи физиологических наук. – 2001. – Т. 32. - № 1. – С.3 – 18.
7.    Piedrahita J.A. Targeted modification of the domestic animal genome // Theriogenology. – 2000. – V. 53. – P. 105 – 116
8.    Fletcher L. US stem cell policy comes under fire // Nature Biotechnology. - 2001. - V.19, - №10. - P.893-894.
9.    Bonnie Joy Sedlak. Acquiring Stem Cells for Research // Genetic Engineering News. – 2001. – V.1. - № 16. – P.1.
10.    Vicki Brower. Stem Cell RD Advances In Face of Challenges // Genetic Engineering News.- 2003. – V. 23. - № 9. – P. 1.