Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН, Новосибирск

Эта работа опубликована в сборнике научных трудов «Естествознание и гуманизм» (2005 год, Том 2, выпуск 3), под редакцией проф., д.б.н. Ильинских Н.Н. Посмотреть титульный лист сборника

В настоящее время клеточная культура Нер-2 широко используется для проведения многих исследований прикладного и теоретического характера в различных областях биологии и медицины [1; 2]. Важным критерием, определяющим стабильность культуры, как и любой другой клеточной популяции, считают устойчивость её элементов к спонтанному апоптозу [3; 4; 5; 6]. Длительно поддерживаемая in vitro культура Нер-2 является перевиваемой линией клеток карциномы гортани человека [1; 2]. Поэтому она может быть использована в качестве модели проявления спонтанного апоптоза в опухолевых клетках при экспериментальных онкологических исследованиях. Информацию о резистентности этой культуры к апоптозу, некрозу и дистрофии необходимо учитывать во время совместной инкубации с иммунокомпетентными клетками при моделировании иммунного гранулематозного воспаления, индуцированного злокачественной опухолью [1]. Исходя из вышесказанного, целью исследования являлось определение резистентности клеток культуры Нер-2 к спонтанному апоптозу, некрозу и дистрофии.
Клетки инкубировали в термостате при температуре 370 С в растворе Игла с гидролизатом лактальбумина, добавлением L-глутамина и сыворотки крупного рогатого скота. Препараты фиксировали 50 % раствором этанола и окрашивали азур – эозином. Исходная концентрация посадки в контрольной группе составляла 100 тыс. клеток культуры Нер-2, а в первой и во второй экспериментальных группах она была соответственно 50 и 25 тыс. на 1 мл. Подсчитывали количество клеток, имевших признаки апоптоза, некроза, и клетки в состоянии дистрофии. Определяли концентрацию апоптозных телец на 100 клеток. Результаты оценивали на 24, 48, 72 и 96 часов инкубации. Контролем служили культуры, инкубируемые в течение 24 часов. Все последующие изменения описаны относительно контроля.
Клетки культуры Нер-2 при начальной концентрации 100 тыс. в 1 мл подвергались апоптозу с одинаковой частотой на 24, 48 и 72 часа инкубации, что составляло 5 % от общего числа клеток. На 96 часов наблюдения их количество снижалось в 2,2 раза по сравнению с контрольными культурами (на 24 часа). Численность клеток с признаками фрагментации цитоплазмы превосходила количество клеток с фрагментацией ядра на все сроки экспозиции, за исключением 96 часов, когда наблюдали диаметрально противоположную ситуацию. Количество апоптозных телец имело тенденцию к снижению, начиная с 72 часов инкубации. Число некротизированных клеток прогрессивно увеличивалось, и на 96 часов было больше по сравнению с контрольным параметром в 2,1 раза. Показатели концентрации дистрофически измененных клеток на все сроки наблюдения не имели между собой достоверных различий. Они снижались к 72 часам экспозиции. Максимальные значения митотической активности были зарегистрированы через 72 часа инкубации. Количество клеток в состоянии митоза на указанный срок превосходило контрольный показатель в 3,8 раза.
Из вышесказанного следует, что в культуре Нер-2 отмечали высокую концентрацию клеток в состоянии апоптоза (в контрольный срок наблюдения), которая затем уменьшалась. Митотическая активность напротив, сначала нарастала, достигая максимального уровня, и держалась на нем в течение 2 суток. Вероятно, такое разнонаправленное течение указанных процессов способствует поддержанию баланса между погибшими и новообразованными клетками, который, однако, остается отрицательным на все сроки наблюдения. Большинство апоптозных клеток Нер-2 имели фрагментированную цитоплазму. Апоптозные тельца не подвергались фагоцитозу, а их наивысшую концентрацию находили через 48 часов от начала инкубации. Клетки линии Нер-2 подвергались некрозу одинаково часто на все сроки культивирования, за исключением повышения их содержания через 96 часов. Численность дистрофически поврежденных клеток на 72 часа инкубирования имела тенденцию к снижению.
Две группы с уменьшенной исходной концентрацией клеток в культурах отличались от контрольной тем, что на 48 часов инкубации имели максимальную активность процесса апоптоза, которая двукратно превосходила начальную и снижалась в дальнейшем. В контрольной группе проявления апоптоза имели тенденцию к уменьшению, начиная уже с 48 часов экспозиции. Во всех группах и на все отмеченные сроки наблюдения клетки в состоянии апоптоза чаще имели фрагментированную цитоплазму. Ядро подвергалось фрагментации значительно реже (в 30 % случаев). Численность апоптозных телец во всех группах имела тенденцию к увеличению на 48 и 72 часа инкубации. Максимальное значение разницы содержания апоптозных телец в культурах наблюдали на 72 часа экспозиции. Численность апоптозных телец в группах культур с исходной концентрацией клеток 25 тыс. и 50 тыс. в 1 мл превосходила контрольную на указанные сроки, соответственно в 3,4 и в 5,3 раза. Эти группы имели более высокую численность апоптозных телец по сравнению с контролем на все сроки экспозиции. В целом аналогичная ситуация прослеживалась и в отношении количества клеток с признаками дистрофии. Содержание таких клеток в опытных группах превосходила контрольные параметры в 1,5 - 2 раза на различные сроки инкубации. Достоверных различий в содержании некротизированных клеток в культурах, в зависимости от исходной концентрации посадки, не наблюдалось. Во всех группах максимальное количество клеток в состоянии некроза находили на 96 часов экспозиции.
Степень проявления митотической активности имела прямую зависимость от исходной концентрации клеток во взвеси. В опытных группах максимальное количестве клеток в состоянии митоза было на 24 часа позже, чем в контрольной. Достоверное увеличение количества митотически активных клеток относительно исходного уровня в контрольной группе наблюдалось на 48 часов экспозиции, и только на 72 часа инкубации - в опытных группах. В опытных группах возрастание митотической активности имело линейную зависимость от сроков инкубации, начиная с 48 часов культивирования. В отличие от этого, в контроле митотическая активность сначала нарастала, достигая максимального уровня, и держалась на нем в течение 2 суток,  а к 96 часам инкубации уменьшалась.
Таким образом, были выявлены морфологические различия и динамические изменения в активности течения апоптоза, некроза и дистрофии в культуре Нер-2 в зависимости от длительности инкубации и исходной концентрации посадки клеток. Баланс между погибшими клетками и образованными в результате митотического деления был отрицательным на всех сроках наблюдения до 96 часов.

Список литературы
1. Ильин Д.А., Архипов С.А., Михайлова Л.П., Игнатович Н.В., Ахроменко Е.С. Морфоцитологические аспекты взаимодействия клеток в генетически гетерогенных клеточных культурах // Компенсаторно-приспособительные процессы: Всероссийская конференция. — Новосибирск, 2004. — С. 32-33.
2. Казначеев В.П., Михайлова Л.П. Сверхслабые излучения в межклеточных взаимодействиях. — Новосибирск: Наука, 1981. —144 с.
3. Фильченков А.А., Абраменко И.В. Апоптоз в патогенезе заболеваний человека. — К.: ДИА, 2001. —324 с.
4. Brodbeck W.G., Shive M.S., Colton E., Nakayama Y., Matsuda T., Anderson J.M. Influence of biomaterial surface chemistry on the apoptosis of adherent cells // J. Biomed. Mater. Res. - 2001. - V. 55. - № 4. - Р. 661- 668.
5. Kluck R.M., Bossy-Wetzel E., Green D.R., Newmeyer D.D. The release of cytochrome c from mitochondria: a primary site for Bcl-2 regulation of apoptosis // Science. - 1997. - V. 275. - P. 1132-1136.
6. Agostini C., Perin A., Semenzato G. Cell apoptosis and granulomatous lung diseases // Curr. Opin. Pulm. Med. - 1998. - V. 4. - № 5. - Р. 261 - 266.