Фактор некроза опухоли альфа (TNFa) представляет собой мощный стимулятор рецепторного пути апоптотической гибели клеток. Несмотря на пристальное изучение апоптоза, опосредованного TNFa, все же остаются вопросы, касающиеся участия данного цитокина в активации альтернативных механизмов реализации танатогенной программы, связанных с транскрипционными факторами и белками семейства Bcl-2 [2]. В связи с этим, целью настоящего исследования явилась оценка участия транскрипционных факторов (NF-kB и Р53) и белков семейства Bcl-2 в реализации TNFa-индуцированного апоптоза лимфоцитов крови.

Выделенные в стерильных условиях лимфоциты, полученные у 12 здоровых доноров в возрасте 22-30 лет, были инкубированы в течение 18 ч в полной культуральной среде, содержащей 90% RPMI-1640, 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, без цитокина или с добавлением рекомбинантного TNFa (rTNFa) человека («Biosource», Бельгия) в концентрации 0,05 нг/мл. В аннек-синовом тесте оценивали количество апоптотических лимфоцитов («Beckman Coulter», Франция). Методом вестерн-блоттинга с использованием моноклональных антител («Sigma Aldrich», США) в лимфоцитах определяли количество свободного NF-kB, нефосфорилированного Р53, p21WAF1/Cip1, белков семейства Bcl-2 (Bax, Bad, Bcl-2, Bcl-xL). Статистическую обработку результатов проводили с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни.

Исследование показало, что rTNFa в концентрации 0,05 нг/мл существенно увеличивает количество лимфоцитов в апоптозе. При этом было зарегистрировано статистически значимое снижение содержания в клетках нефосфорилированного Р53, что, на наш взгляд, связано с принятием данным белком активной фосфоформы. Об этом свидетельствует достоверное увеличение в лимфоцитах количества ингибитора циклинзависимых киназ p21WAF1/Cip1, образование которого является Р53-зависимым [1]. Анализ содержания в лимфоцитарных клетках другого транскрипционного фактора NF-kB показал, что TNFa способствует накоплению его свободной формы.

Под контролем Р53 и NF-kB находится транскрипция генов важнейших регуляторов апоптоза, в том числе и белков семейства Bcl-2 [2, 3]. Инкубирование лимфоцитов в среде с rTNFa привело к снижению в клетках содержания антиапоптотических белков Bcl-2 и Bcl-xL, а также проапоптотиче-ского Bax по сравнению с интактной культурой. Вероятно, это связано с возможностью образования гетеродимеров - Bcl-2/Bax и Bcl-xL/Bax, участвующих в пермеабилизации мембраны митохондрий [3]. Зафиксированное повышение количества в лимфоцитах белка Bad, транскрипция которого контролируется Р53, по всей видимости, необходимо для подавления антисуицидальных эффектов Bcl-2 и Bcl-xL, что ведет к открытию митохондриальных пор и выходу апоптогенных факторов в цитоплазму [3].

Таким образом, TNFa-опосредованный апоптоз лимфоцитов крови сопряжен с одновременной активацией транскрипционных факторов Р53 и NF-kB, снижением в клетках содержания антиапоптоти-ческих Bcl-2, Bcl-xL и проапоптотического Bax, а также повышению количества апоптогенного белка Bad.