Эта работа опубликована в сборнике статей с материалами трудов 1-ой международной телеконференции "Проблемы и перспективы современной медицины, биологии и экологии". Название сборника "Фундаментальные науки и практика Том 1, №1"

Посмотреть обложку сборника

Скачать информацию о сборнике (в архиве: обложка, тит. лист, оглавление, список авторов)

Полное название:

Исследование влияния острой гипобарической гипоксии на включение С¹⁴  изотопа глюкозы в состав липидов инкубированной печени крыс

 Белякова М.Б., Лещенко Д.В., Боринский Ю.Н., Костюк Н.В., Миняев М.В.

Тверская государственная медицинская академия (г.Тверь)

Тверской государственный университет

Гипоксия считается компонентом большинства патологических состояний, часто предшествуя гибели организма, сопровождая развитие посмертных процессов в органах и тканях [Агаджанян Н.А., 1998]. Одним из важнейших механизмов этих изменений является запуск аутолитических процессов, вызываемый энергодефицитным состоянием [Arora A.S., 2005] , поэтому большое значение для их реализации имеют не только факторы среды переживания, но и условия, предшествовавшие смерти. Аутолиз клетки сопровождается деградацией структурных компонентов мембран, в связи с чем значительный интерес вызывают посмертные изменения липидов. Гипоксия приводит к значительной перестройке обмена липидов, в частности, ограничением их биологического окисления [Шевченко Ю.Л., 2000],  что должно влиять на липидный состав переживающих тканей. Число работ, посвященных изучению этой темы, невелико [Грибанов Г.А., 1986; Yanoshita K.R., 1993; Лещенко Д.В., 2003], но они указывают на подверженность посмертных превращений липидов влиянию предшествующих смерти кислородных условий. Данные по включение углеродного скелета глюкозы в липидный компонент под действием гипоксии неоднозначны [Hervant F., 1999], в связи с чем нами предпринято исследование влияния гипоксии на включение радиоактивных изотопов углерода глюкозы в состав общих липидов печени крыс при инкубации.

Острую гипоксию у животных создавали барокамерным методом в течение 1,5 часов на высоте 10.500 м при давлении, соответствующем высоте. За 30 мин до острой гипоксии все крысы получали инъекцию С¹⁴ глюкозы в дозе 300 мг/кг веса животного. Использовался препарат D-[U-14-C] GLUCOSE HIGH SPECIFIC ACTIVITY, произведенный фирмой Amersham Pharmacia Biotech UK Limited (Англия), активность 11,5 ГБк/ммоль (60,6 МБк/мг), или 311 мКи/ммоль (1,64 мКи/мг). Контрольные животные после инъекции радиоактивной метки находились в обычных условиях.

Сразу после гипоксии крыс умерщвляли эфирным наркозом, из каждого животного выделяли два препарата печени. Один образец ткани анализировали сразу,  другой - после инкубации в физиологическом растворе в течение 10 мин при температуре 37⁰С. Модель инкубации in vitro срезов ткани позволяет до некоторой степени имитировать возврат к нормоксии и нормализацию ацидоза внеклеточной среды, и таким образом изучить постгипоксические перестройки липидов. Экстракцию проводили по методу Блайя и Дайера, фракционирование - методом хроматографии на силикагеле. Количественное определение отдельных фракций проводили методом сжигания с концентрированной серной кислотой. Включение  меченых атомов в состав общих липидов и их фракций измеряли при помощи жидкостного сцинтилляционного счета. Количество вспышек регистрировали при помощи установки для радиобиохимических исследований БЕТА-2.

Результаты определения количества общих липидов печени крыс и их удельной радиоактивности представлены в табл. № 1.  По данным видно, что гипоксия снижала среднее содержание общих липидов (ОЛ), но из-за значительного разброса статистически недостоверно.

 Табл. №1. Содержание и радиоактивность общих липидов в образцах печени контрольных и «гипоксических» крыс до и после инкубации, M ± m, n=3.

*Достоверная разность с аналогичным сроком в контроле.

Такое снижение ОЛ из расчета на сырой вес ткани в условиях острой гипоксии можно связать с замедлением ресинтеза при энергодефицитном состоянии, с обводнением органа, а также со снижением активности печеночной липазы [Bruder E.D., 2004]. После 10-минутной инкубации также значимых изменений не отмечено в препаратах печени обеих групп крыс, но можно увидеть тенденцию к снижению в контроле и к увеличению – после гипоксии. Такие изменения на ранних сроках посмертной инкубации можно объяснить активацией механизмов образования липидов во время гипоксии и затем увеличением скорости процесса после попадания переживающего препарата в нормоксические условия инкубации, так как  в клетках остаются субстраты окисления, которые не могли быть окислены в гипоксических условиях [Villalobos-Molina R., 1998]. В контрольных препаратах, видимо, ресинтез замедляется из-за более быстрого исчерпания таких субстратов.

Рассматривая включение меченых углеродных атомов глюкозного скелета в состав ОЛ, можно отметить, что как в контроле, так и после гипоксии липиды не изменяли радиоактивность после инкубации по сравнению с начальными значениями. Предполагалось, что за два часа между инъекцией и забоем должна произойти полная ассимиляция радиоактивной глюкозы, на что косвенно указывает наш результат. Однако, принимая во внимание, что печень принимает участие в конверсии организменного лактата, в «гипоксических» препаратах могли накапливаться радиоактивные продукты гликолиза, усиление утилизации которых произошло при нормоксической инкубации. Такая тенденция, хотя и не подтвержденная статистически, по нашим результатам может быть отмечена: в «гипоксических» препаратах несколько увеличиваются средние значения и по содержанию ОЛ, и по их удельной радиоактивности.

Сравнивая радиоактивность ОЛ экспериментальных препаратов с контрольными значениями, можно отметить, что гипоксия вызывает увеличение включения меченых атомов в состав липидов, однако это статистически значимо показано для инкубированных препаратов.

В табл. №2 представлено относительное содержание фракций в массовых процентах от их общей суммы, рассчитанное в виде средних по всем группам препаратов. Согласно результатам, гипоксия повлияла на процент содержания диглицеридов (ДГ) и свободных жирных кислот (СЖК) – фракций, представляющих собой продукты гидролиза других липидов. После гипоксии увеличено количество ДГ и уменьшено – СЖК. Видимо, гипоксия изменяет активность гидролитических ферментов, что отмечалось и ранее [Helmy F.M., 2004]. После нормоксической инкубации относительное количество ДГ уменьшается вдвое, вероятнее всего, путем гидролиза и дальнейшего окисления, так как содержание метаболически связанных фракций не изменяется, и увеличивается количество эфиров холестерина (ЭХ). Последнее не сопровождается снижением уровня холестерина, поэтому более вероятной причиной являлось улучшение экстракции ЭХ, связанных с липопротеидами, после инкубации. В контроле отмечается значительное накопление СЖК с тенденцией к убыли триглицеридов (ТГ) и резкое снижение холестерина после инкубации с тенденцией к увеличению уровня его эфиров, вероятно, из-за необходимости утилизации СЖК путем эстерификации. Видимо, липаза печени в гипоксических условиях была менее активной.

Таблица №2. Относительное содержание отдельных фракций общих липидов в печени до и после инкубации препаратов, M ± m.

Здесь и далее:  * слева - достоверное различие между  значениями до и после инкубации,       

                          * справа – достоверное различие по сравнению с контролем.

В табл. №3 аналогичным образом представлены усредненные данные по радиоактивности отдельных фракций, в виде процентного вклада каждой фракции в суммарную активность всей серии.

Таблица №3. Относительная радиоактивность отдельных фракций общих липидов в препаратах печени, выделенных после гипоксии.

Как видно из результатов, наблюдаемая радиоактивность свежевыделенных образцов (0 мин условно) зависит только от некоторых фракций. Во всех без исключения препаратах значительное число сцинтилляционных вспышек отмечалось при исследовании фосфолипидов (ФЛ) и ТГ, и полное их отсутствие – при анализе ЭХ. Первое можно объяснить активным ресинтезом ФЛ и ТГ в печени.

Очевидно, что вклад радиоактивности ФЛ почти совпадает с их массовым вкладом в сумму фракций. Почти вся остальная радиоактивность приходится на долю ТГ, причем их массовая доля более чем в два раза меньше. Направление динамики содержания всех фракций практически совпадает с динамикой их радиоактивности. Интересным исключением явились ФЛ в контрольной группе – достоверный прирост их активности не сопровождается изменением их концентрации. Предполагая исчерпание углеводных меченых субстратов для ресинтеза ФЛ и имея в наличии снижение ТГ в этих препаратах как по содержанию, так и по активности, можно предположить использование гепатоцитами ТГ для ресинтеза ФЛ по трансацилазному механизму в условиях изоляции. Возможно, исчерпание углеводных субстратов для ресинтеза ФЛ не происходило, тогда можно считать, что изотопная метка продолжала включаться в липиды до конца нашего эксперимента, одновременно убывая посредством липолиза ТГ. После гипоксии имеется тенденция к снижению активности ФЛ при их стабильном содержании в ходе инкубации, однако не подтвержденная статистикой.

 Таким образом, инкубационная модель позволила получить свидетельства метаболических нарушений, не проявляющихся прижизненным изменением состава тканей вследствие воздействия физических условий (гипоксии). Динамика радиоактивности фракций липидов печени подтвердила, что гипоксия ускорила включение углеводных субстратов в состав липидов, причем преимущественно в глицериды, но не в другие ацилсодержащие липиды, поэтому мы полагаем основным переносчиком атомов глюкозы в состав ФЛ и ТГ глицерол-3-фосфат.