Дагестанский государственный университет

Эта работа опубликована в сборнике научных трудов «Проблемы и перспективы современной науки» (2008 год, выпуск 2), под редакцией проф., д.м.н. Ильинских Н.Н. Посмотреть титульный лист сборника

Загрязнение водоемов нефтью и нефтепродуктами – один из самых  распространенных видов техногенного прессинга. Наиболее загрязнены донные осадки акваторий портов, судоходных каналов, морских нефтепромыслов. Для анализа состояния водных экосистем в условиях интенсивного антропогенного воздействия важно знать о реагировании гидробионтов на загрязнение среды. Анализ изменений в метаболических процессах и генетическом аппарате клетки способствует выявлению действия повреждающих факторов среды на организм, углублению представлений о процессах интоксикации, так как на молекулярном уровне изменения проявляются раньше, чем на уровне организма.
В связи с этим целью работы является исследование биохимических параметров белково-липидного обмена  и цитогематологических показателей рыб при хроническом воздействии нефти.
Материал и методы исследований. Объектами модельных опытов служили: мальки кутума (Rutilus frisii kutum) в возрасте 54 дня, привезеные с Нечаевского осетрового рыбоводного завода «Сулак» (Республика Дагестан) и ее молодь; взрослые особи северокавказской воблы (Rutilus rutilus caspicus) и сеголетки карпа (Cyprinus carpio) из прудов Широкольского рыбоводного комбината; двухлетки красноперки (Scardinius erithrophthalmus), отловленные в южной части Аграханского залива Каспийского моря. Моделирование хронического нефтяного загрязнения водной среды (5-70 суток) проводили в аквариальных условиях. В качестве токсиканта использовали сырую нефть (0,05; 0,1; 0,5 и 1,0 мг/л), а в эксперименте с северокавказской воблой высокопарафинированную нефть (1,25; 2,5; 5,0; 10,0 мг/л). В опытах и контроле рыбы содержались в аквариумах с постоянной аэрацией и одинаковым режимом питания при температуре воды 20–25ОС. Контролем во всех опытах служили рыбы из аквариумов с чистой водой.
        Изучали динамику содержания суммарных фосфолипидов (Кушманова, Ивченко, 1983), общего холестерина (Методы биохимических исследований, 1982), общего белка, белковых фракций и активность кислой протеиназы (Lowry et. al., 1951; Пушкина, 1963) в 1% мышечных гомогенатах рыб, цитогенетический анализ эритроидных клеток путем учета микроядер (Захидов и др., 1993), определение гемоглобина, эритроцитов (Терскова, Гительзон, 1957), подсчет лейкоцитарной формулы (нейтрофилов, моноцитов, лимфоцитов). Статобработку данных провели методом малой выборки (Лакин, 1990) по t-критерию Стьюдента (р≤0,05).
Результаты и их обсуждение. Исследование содержания общего белка при хроническом воздействии сырой нефти (0,05–1,0 мг/л) на мальков кутума показало, что уже через 10 дней экспозиции при концентрациях нефти 0,5 и 1,0 мг/л происходит снижение количества белка в мышечной ткани подопытных рыб с тенденцией к повышению на 20-е сутки опыта. В вариантах с 0,05 и 0,1 мг/л нефти значения общего белка соответствовали контрольным. При пролонгированном воздействии нефти содержание белка у интактных рыб снижалось (кроме концентрации 0,05 мг/л), особенно на 70-е сутки опыта (на 23,0; 14,0 и 16,3% соответственно при 0,1; 0,5 и 1,0 мг/л нефти), что свидетельствует о преобладании катаболических процессов в организме рыб. Кратковременное фазовое повышение белка может быть связано с усилением синтеза стрессовых белков и металлотионеинов.
Динамика активности кислой пептид-гидролазы мышечной ткани кутума при действии нефти имела вид волнообразной кривой с повышением на 10-е сутки опыта и последующим ингибированием по сравнению с контролем. На 70-е сутки опыта активность катепсинов достоверно повышалась по отношению к контролю с увеличением концентрации нефти в среде на 30,1%, 12,8% и 31,6% соответственно в вариантах 0,1; 0,5; 1,0 мг/л, а при концентрации нефти 0,05 мг/л была приближена к контрольным значениям. Согласно нашим данным, автолитическая активность в мышечной ткани интактных рыб в течение первого месяца влияния нефти незначительно превышала протеолитическую, а на 70-е сутки снизилась, за исключением  варианта с 1,0 мг/л нефти в воде (на 30,5% выше, чем в контроле).  
Полученные данные свидетельствуют, что при воздействии на молодь кутума концентраций нефти 0,05; 0,1 и 0,5 мг/л в течение всего периода опыта адаптивные механизмы организма рыб успешно функционируют, но при концентрации 1,0 мг/л начинаются деструктивные процессы.  Таким образом,  лизосомальные протеиназы проявляют адаптивную функцию в ответе организма рыб на антропогенное воздействие (Немова, Сидоров, 1990; Немова и др., 2002; Курбанова и др., 2004). Снижение активности кислой протеиназы можно объяснить ингибирующим действием отдельных составляющих нефти, как многокомпонентного токсиканта, или стрессовыми метаболитами гидролитических процессов.
Электрофоретическое исследование мышечных белков молоди кутума при действии нефти (0,05–1,0 мг/л) выявило фазово-мозаичные изменения в количественном соотношении белковых фракций, выразившиеся  в диспротеинемии и парапротеинемии (появлении посторонних патологических белков).  После 70-дневного воздействия нефти отмечено снижение альбуминовой фракции, особенно при концентрациях 0,5 и 1,0 мг/л (на 25,4 и 44,4% соответственно), что говорит об их расходовании организмом рыб в условиях интоксикации. Содержание альфа1-глобулинов (за исключением варианта с 0,05 мг/л нефти в воде) у подопытных кутумов понижено, содержание альфа2-глобулинов, напротив, повышалось по мере роста концентрации нефти. Бета-глобулиновая фракция плавно уменьшалась, а гамма-глобулиновая возрастала пропорционально концентрации нефти. Выявленные диспротеинемии  свидетельствуют о нарушениях в липидном обмене рыб и развитии  воспалительно-аллергических реакций уже на 10 сутки действия нефти. При пролонгированном влиянии нефти защитные механизмы организма рыб угнетаются, что выражается в стойком снижении гамма-глобулиновой фракции и иллюстрирует развитие хронической патологии.  
Воздействие высокопарафинированной нефти (1.25; 2,5; 5,0; 10,0 мг/л)  в хроническом режиме на липидный обмен северокавказской воблы также вызвало определенные модификации в содержании и соотношении фосфолипидов и холестерина. Так, на 5-е сутки отмечено достоверное (на 18%) по отношению к контролю снижение количества холестерина в мышечной ткани воблы при концентрациях нефти в воде 2.5 и 5,0 мг/л; на 10-е сутки уровень показателя у рыб из аквариумов с содержанием токсиканта 1,25; 2,5 и 10,0 мг/л упал на 21, 26 и 30% соответственно. 15-е сутки воздействия характеризовались относительной стабилизацией, за исключением 2-го варианта (2,5 мг/л), где содержание общего холестерина значительно повышено (на 25%) относительно контроля. К концу эксперимента (25-е сутки) наблюдалось снижение уровня холестерина во всех вариантах на 15; 26; 28 и 20% соответственно возрастанию концентрации нефти.
Динамика содержания суммарных фосфолипидов имела разнонаправленный характер на протяжении всего опыта. Так, 5-е сутки воздействия характеризовались повышением содержания фосфолипидов значительно (на 23%) во 2-м варианте и незначительно в 3-м и 4-м. На 10-е и 20-е сутки эксперимента наблюдалось снижение показателя во всех вариантах: значительно в 1-м и 2-м - на 10-е сутки (22 и 17% соответственно), в 3-м на 15-е сутки (17%) относительно контрольных значений.
Если считать, что накопление фосфолипидов в тканях свидетельствует о процессах адаптации молоди к стрессовому воздействию загрязнителя, то резкое снижение содержания суммарных фосфолипидов, сопровождающееся, как известно,  накоплением неэтерифицированных жирных кислот и лизосоединений в тканях, может служить показателем усиления перекисного окисления мембранных липидов ( Исуев и др., 1998; Уцов, 2002).
    Изучение морфологии крови является важным показателем в токсикологических исследованиях. При хроническом воздействии сырой нефти (5–40 суток) в концентрации 0,5 мг/л у сеголеток карпа и  двухлеток красноперки развивалась анемия, снижалось содержание гемоглобина (на 28,3; 21,3 и 63,1% соответственно на 5; 15 и 30-е сутки опыта). Значительно снижался уровень лейкоцитов (во все периоды воздействия нефти и значительнее всего на 30-е сутки: на 38,9%), наблюдались изменения в соотношении отдельных форм лейкоцитов. На 5-е сутки воздействия сырой нефти уровень нейтрофилов выше контроля в 2,5 раза, в то время как на 15 и 30-е сутки это увеличение статистически недостоверно (р>0,5). Загрязнение водной среды нефтью вызывало существенное увеличение количества моноцитов и более всего на 5-е сутки (в 3,5 раза выше контроля). На 15-е и 30-е сутки интоксикации уровень моноцитов в крови двухлеток красноперки оставался повышенным. У опытных рыб отмечен полиморфоядерный лейкоцитоз - снижение количества лимфоцитов (на 19,5% к 30-м суткам опыта), увеличение количества нейтрофилов и моноцитов.
    Результаты цитогематологических исследований и литература (Кондратьева и др., 2001; Горбунова и др., 2003) указывают на взаимосвязь между изменением содержания в крови лейкоцитов и иммунными свойствами крови рыб при нефтяном загрязнении.  С помощью метода учета микроядер нами показано, что в периферической крови рыб при действии сырой  нефти частота встречаемости эритроцитов со следами хромосомных поломок значимо превышало уровень спонтанно  возникающих мутаций на 5; 15; 30 и 40-е сутки воздействия. В течение всего опыта в популяции  эритроидных клеток наблюдалось статистически значимое увеличение против нормы числа клеток с микроядрами и двуядерных клеток.  
    Исследование влияния сырой нефти на накопление индуцированных генетических повреждений в эритроцитах сеголеток карпа и двухлеток красноперки показали высокие уровни генетически аберрантных клеток (в 1,4-7,3 раза выше), чем в контроле. Несмотря на отмеченное   статистически значимое увеличение числа микроядер и двуядерных эритроцитов, в крови рыб была выявлена кластогенная активность. Очевидно, это связано с условиями модельного эксперимента либо с сильными цитотоксическими эффектами сырой нефти, приводящих к массовой клеточной гибели, в результате которой и происходит искусственное занижение клеток со следами хромосомных аномалий (Тates, Engels, 1989).
Известно, что нефть вызывает усиление перекисного окисления липидов. Свободно-радикальному окислению подвергаются не только жирные кислоты липидов, но и молекулы ДНК и белков. В белках окисляются некоторые аминокислоты, структура белков разрушается, все это активирует протеолитические ферменты, гидролизирующие поврежденные белки (Биохимия, 2004). Хроническое токсическое воздействие нефти чревато необратимыми нарушениями метаболизма и гибелью рыб, что представляет определенную экологическую опасность.
Проведенные исследования позволяют заключить, что токсическое воздействие нефти на рыб проявляется в виде существенных биохимических и цитогемалогических изменений. Представленные данные иллюстрируют возможность использования показателей белкового и липидного обмена и цитогематологические параметры в качестве биомаркеров при проведении эколого-биохимического и  цитогенетическом мониторинге водной среды.

Литература
1. Биологические  мембраны. Методы /Под. ред. Финдлея Дж. Б., Эванза У. Г.: Мир, 1990. - 424 с.
2. Биохимия: Учебник / Под ред. Е.С.Северина. 2-е изд. М.: Геотар-Мед, 2004.  784 с.
3. Горбунова Г.С., Костров Б.П., Горбунова Н.В. Влияние нефти, газоконденсата и отходов бурения на показатели крови рыб. // В сб. Рыбохозяйственные  исследования на Каспии. Астрахань. 2003. С.109-113.
4. Захидов С.Т., Карпюк М.И., Галиченков В.А. Цитогенетический мониторинг волжского бассейна. Уровни хромосомных мутаций в половых и соматических клетках самцов стерляди // Изв. РАН, сер. Биол.- 1993а. №1. С. 102-106.
5. Исуев А.Р., Габибов М.М., Магомедгаджиева Д.Н., Гусейнова С.А. Перекисное окисление липидов и антиоксидантная активность сеголеток русского осетра при загрязнении водной среды нефтью // Вестник ДГУ. Махачкала: ИПЦ ДГУ, 1998. С. 92-95.
6. Кондратьева И.А., Киташова А.А., Ланге М.А. Современные представления об иммунной системе рыб // Вестник Моск. ун-та. сер.16. Биология.2001. №4. С.11-20.
7. Курбанова И.К., Исуев А.Р., Габибов М.М. Влияние нефтяного загрязнения водной среды на некоторые показатели белкового обмена мальков кутума Rutilus frisii kutum (Cypriniformes, Cyprinidae) // Вопросы ихтиологии. 2004.  Т.44, №5. С.700-708.
8. Кушманова О.Д., Ивченко Г.М. Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии. -М.: Медицина, 1983. 272 с.
9. Лакин Г.Ф. Биметрия. М.: Высшая школа, 1990. 352с.
10. Немова Н.Н., Сидоров В.С. Влияние некоторых токсикологических факторов на лизосомальные протеиназы пресноводных рыб // Гидробиол. Журн. 1990. Т.26. №4. С. 69-73.
11. Немова Н.Н., Высоцкая Р.У., Сидоров В.С. Эколого-биохимическое тестирование водоемов по состоянию рыб // Научные аспекты экологических проблем России. Т.1. М.: Наука, 2002. С. 215-220.
12. Терсков И.А., Гительзон И.И. Метод кислотных эритрограмм // Биофизика. 1957. т.2, вып.2. С..259-266.
13. Пушкина С.В. Биохимические методы исследования. М.: Наука, 1963. 230 с.
14. Уцов С.А. Влияние токсикантов нефтегазовых разработок на ихтиофауну Среднего Каспия: Автореф. Дисс. … канд. биол. наук. М., 2002. 22 с.
15. Lowry D.H., Rosebrough H.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folinphenol reagent // J. Biol. Chem., 1951. Vol. 193.  P. 265-275.
16. Tates A.D., den Engels L. The role of the induction of micronuclei in rat liver by ethylnitrosourea and methyl methanesulphonate: the importance of experimental design // Mutat. Res.- 1989.- vol.210, №2. p.271.