Эта статья опубликована в сборнике статей по материалам XII Российского конгресса молодых  ученых  с  международным  участием "Науки о человеке"  (Томск, 26-27 мая 2011 г.) / под ред.   Л.М. Огородовой, Л.В. Капилевича. – Томск: СибГМУ. – 2011. – 104 с. 

Скачать сборник целиком (PDF, 1,6 MB)

К активным формах кислорода (АФК) относят широкий класс кислородных соединений радикальной и нерадикальной природы (супероксиданион радикал - O₂^* , гидроперекисный радикал - НO₂*, гидроксильный радикал - НО^*, синглетный кислород - 102, пероксид водорода - Н₂O₂, гипохлорит - ОСГ, радикал NO - NO*) [3]. Содержание кислородных радикалов в клетке может увеличиваться, если повышается скорость образования АФК или снижается способность ферментативных систем к их нейтрализации. Стойкое увеличение в клетках уровня свободно-радикальных соединений приводит к развитию окислительного стресса (ОС) [1].

Одним из важнейших элементов редокс-системы клеток являются супероксид анион и оксид азота (NO). Вопрос о том, являются ли они вторичными посредниками или модуляторами оперирования «классических» вторичных мессенджеров остается открытым. Известно, что основные эффекты влияния ОС на функциональные свойства клеток, в частности на сократительную активность мышечных клеток, связаны с увеличением концентрации АФК.

Объектом исследования явились изолированные сегменты грудного отдела аорты беспородных белых крыс, которые являются традиционной моделью артериального сосуда мышечного типа. После выделения аорту помещали в физиологически сбалансированный солевой раствор Кребса, с помощью хирургических ножниц отпрепаровывали жировую и соединительную ткань и выделяли сегменты шириной 2-3 мм. Эндотелий удаляли механически, вращением деревянного шпателя в просвете сегмента в течение 1 минуты непосредственно перед выполнением эксперимента.
Для исследования сократительной активности гладких мышц использовался метод механогра- фии. После предварительной нагрузки 500 мг сегменты фиксировались в термостатируемой перфузи- онной камере в условиях постоянной перфузии раствором Кребса (1мл/мин). Измерение механического напряжения ГМК проводилось с использованием сертифицированной четырехканальной меха-нографической установки Myobath II и аппаратно-программного комплекса LAB-TRAX-4/16 (Германия).

Амплитуду контрольных (100%) сократительных ответов сосудистых сегментов на действие гиперкалиевого раствора (замена 30 мМ NaCl на KCl) или фенилэфрина (10 мкМ) регистрировали после 40-50 минут выдерживания в нормальном растворе Кребса.

Физиологический раствор Кребса содержал (в мM): 120.4 NaCl, 5.9 KCl, 2.5 CaCl₂, 1.2 MgCl₂, 5.5 глюкозы, 15 C₄H₁₁О₃N [tris(oxymethyl)-aminometan] (316.4 мосМ), рН раствора - 7.35-7.40, температура 37±0.1°С.

Используемые реактивы: перекись водорода (Россия), фенилэфрин, нитропруссид натрия, метиленовый синий (все Sigma).

Анализ данных проводили при помощи программы Statistica 6.0 for Windows фирмы Statsoft. Фактические данные представлены в виде «среднее ± ошибка среднего» (X±m). Для определения характера распределения полученных данных использовали критерий нормальности Колмогорова- Смирнова. Для проверки гипотезы об однородности двух независимых выборок использовался U-критерий Манна-Уитни (Mann-Whitney U test). Для проверки однородности парных или зависимых, выборок был использован Т-критерий Вилкоксона (Wilcoxon mached pairs test).

Для изучения влияния оксида азота был использован нитропруссид натрия (НП), который широко применяется в научных исследованиях как донор N0. НП (0.001- 0.05 мкМ) не изменял исходное механическое напряжение (МН), снижал величину как гиперкалиевого, так и фенилэфрин (ФЭ)- индуцированного сокращений гладкомышечных клеток (ГМК) аорты, однако более сильный эффект наблюдался при ФЭ-индуцированном сокращении. При гиперкалиевом сокращении расслабление близкое к полумаксимальному наблюдалось при добавлении 0.05 мкМ НП (58.4±4.1%, n=9, р<0.05), а при ФЭ-индуцированном - при 0.005 мкМ НП (42.6±4.1%, n=6, р<0.05).

Предобработка гладкомышечных сегментов ингибитором гуанилатциклазы метиленовым синим (10 мкМ, 30 мин.) достоверно уменьшала расслабляющее действие НП как на гиперкалиевые сокращения (30 мМ KCl) ГМК, так и на ФЭ-индуцированные. Так при гиперкалиевом предсокращении релаксирующее действие НП (0.05мкМ) составляло 27.2±1.8% (n=6, р<0.05), а при ФЭ- индуцированном предсокращении расслабляющее влияние НП (0.005мкМ) составляло 15.7±2.3% (n=6, р<0.05) относительно контрольных значений.

Для определения влияния NO на сокращения, вызванные гиперосмотическим сжатием клеток, НП добавляли в модифицированный раствор Кребса, содержащий 150 мМ сахарозы в качестве не-проникающего осмолита (466.4 мосМ). Повышение осмолярности раствора приводило к развитию воспроизводимого сокращения, амплитуда которого поддерживалась в течение 45 минут от начала аппликации. Амплитуда сокращения вызванного 150 мМ сахарозы составляла 51.8±9.0% (n=6, р<0.05) по сравнению с величиной контрольного гиперкалиевого сокращения.
После добавления 1 0 мкМ НП в гиперосмотический раствор амплитуда сокращения статистически значимо снижалась и составляла 26.3±4.7% (n=4, р<0.05) от контрольного гиперкалиевого сокращения.

Перфузия препаратов гипоосмотическим раствором (40 мМ NaCl) приводила к быстрому тран- зиторному сокращению сегментов аорты крысы, амплитуда которого составляла 69.3±2.1% (n=7) по сравнению с величиной гиперкалиевого сокращения. После добавления 10 мкМ НП в гипоосмотиче- ский раствор амплитуда сокращения не изменялась.
Для получения изоосмотической стрикции сегменты аорты крысы экспонировали в гипоосмо- тической среде (40 мМ NaCl) в течение 60 минут, затем возвращали их в нормоосмотический раствор. Восстановление осмолярности раствора во всех случаях приводило к развитию транзиторного сокращения, амплитуда которого составляла 21.6±8.7% по сравнению с величиной гиперкалиевой контрактуры (n=5, р<0.05). После добавления 10 мкМ НП амплитуда сокращения при изоосмотиче- ской стрикции снизилась до 8.9±3.1% (n=4, р<0.05) по сравнению с величиной контрольной гиперкалиевой контрактуры.

Антагонистом NO является нейтрализующий его супероксидный радикал, также продуцируемый эндотелием. Однако короткий период полураспада ограничивает роль супероксид аниона, как важного паракринного регулятора в сосудах, тогда как его метаболит H₂O₂ - является наиболее устойчивым продуктом обмена кислорода в организме.

Перекись водорода (500 мкМ) не изменяла исходное МН, но вызывала дополнительное (на 25.2±3.8%, n=5, р<0,05) увеличение МН сегментов, предсокращенных гиперкалиевым раствором и, наоборот, уменьшала ФЭ-индуцированное МН сегментов до 51.7±2.9% (n=7, р<0.05).

Увеличение наружной концентрации хлорида калия ведет к деполяризации мембраны ГМК, от-крыванию потенциал-зависимых кальциевых каналов и сокращению, величина которого зависит от концентрации KCl. В ответ на эквимолярное замещение 60 и 120 мМ NaCl на KCl регистрировались сокращения сегментов аорты, амплитуда которых составила 129.1±6.8% и 145.5±13.6% (n=5, р<0.05). H2O2 вызывала дополнительное увеличение механического напряжения сегментов, предсокращенных гиперкалиевыми растворами (60 и 120 мМ KCl) на 25.4 ±7.7% и 26.3±2.3% (n=5, р<0.05), соответственно, от контрольной гиперкалиевой контрактуры (30 мМ KCl).

Прирост МН в ответ на действие ФЭ в условиях инактивационного выключения основных по-тенциал-зависимых механизмов входа ионов кальция обеспечивается открыванием рецептор- управляемых кальциевых каналов. Для изучения влияния Н₂О₂ на рецептор-управляемый вход ионов кальция ФЭ добавляли на фоне действия раствора, содержащего 120 мМ KCl. Фенилэфрин (10 мкМ) в присутствии 120 мМ KCl вызывал повышение МН до 197±19.8 (n=7, р<0.05) от контрольных значений. В этих условиях 500 мкМ Н₂О₂ не влияла на величину МН гладкомышечных сегментов.

Перекись водорода (500 мкМ) не влияла на гиперосмотическое сокращение (150 мМ сахарозы) и изоосмотическую стрикцию. Наоборот при добавления 500 мкМ перекиси водорода в гипоосмотический раствор амплитуда сокращения статистически значимо увеличивалась и составляла 98.2±4.1% (n=7, р<0.05) от контрольного гиперкалиевого сокращения.

Продукция АФК связана как с осуществлением физиологических реакций, так и с повреждением тканей при патологических процессах, включая атеросклероз ишемическую болезнь сердца и др.

Как показали эксперименты, Н₂О₂ потенциал-независимо вызывает дополнительное увеличение механического напряжения сосудистых сегментов, вызванного деполяризацией мембраны ГМК гиперкалиевым раствором, но уменьшает сокращение, индуцированное фенилэфрином. Полученные данные указывают на то, что электромеханическая составляющая процессов сопряжения возбуждения-сокращения сосудистых ГМК активируется перекисью водорода. Проведенные исследования дают основания заключить, что расслабляющее влияние Н₂О₂ на гладкие мышцы, предсокращенные α₁-адреномиметиком фенилэфрином, не связано с угнетением рецептор-управляемого входа ионов кальция в ГМК. Расслабляющее действие Н₂О₂ на фенилэфрин-индуцированное сокращение проявляется только при субмаксимальных концентрациях кальция в клетке. Последнее позволяет допускать угнетение перекисью водорода С-киназной ветви кальциевой сигнальной системы, обеспечивающей поддерживаемое сокращение сосудистых гладких мышц и/или кальциевой десенситизации сократительного аппарата ГМК.

Монооксид азота является важнейшим и наиболее изученным газовым посредником, участвующим во многих вне- и внутриклеточных процессах. Именно с него, с момента открытия в 1986 году эндотелиального фактора релаксации сосудов, началось изучение нового класса сигнальных молекул, названных позднее газотрансмиттерами. Как показали проведенные исследования на гладко-мышечных сегментах аорты крысы, расслабляющее действие N0 на гиперкалиевое и фенилэфрин-индуцированное сокращения, в своей большей части, опосредовано цГМФ.

В регуляцию разнообразных функций клеток, включая сокращение гладких мышц, пролиферацию, рост, программируемую гибель и некроз, вовлечен клеточный объем [4, 5]. Тонкие механизмы связи объема клеток и регуляции их сократительной активности остаются малоизученными. Вместе с тем, показано, что модуляция объема клеток влияет на оперирование основных сигнальных систем клеток, равно как и аппликация биологически важных веществ, активирующих сигнальные системы во многих случаях ведет к изменению объема клеток.

Донор N0 нитропруссид натрия в отличие от Н₂О₂ вызывал снижение механического напряжения при действии гиперосмотического раствора и изоосмотической стрикции, и не влиял на гипоос- мотическое сокращение.

Полученные результаты свидетельствуют о существовании особой ветви регуляции сократительной активности сосудистых ГМК, включающей специфический объем-зависимый ионный транспорт. Изменение объема клеток является своеобразным сигнальным механизмом, который может запускать сокращение гладкомышечных клеток и модулировать возбуждающее действие физиологически активных соединений и деполяризации мембраны.

 

Исследование выполнено в рамках реализации ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 гг. ГК№ П445; ГК№ 02.740.11.5031 и ГК№ 14.740.11.0932.