Эта работа опубликована в сборнике научных трудов «Естествознание и гуманизм» (2006 год, Том 3, выпуск 4), под редакцией проф., д.б.н. Ильинских Н.Н. Посмотреть титульный лист сборника

Нейробиологические исследования последних лет свидетельствуют о возможности восстановления нарушенных болезнью или травмой функций мозга посредством пересадок эмбриональной нервной ткани. В экспериментах доказано, что эмбриональный нейротрансплантат способен развиваться, его клеточные элементы пролиферируют, дифференцируют и интегрируют с мозгом реципиентов. В имплантированной нервной ткани в целом дифференцируются нервные клетки, формируются многочисленные межнейрональные синапсы и единая сосудистая сеть. Пересаженные нейроны обнаруживают спонтанную биоэлектрическую активность, способны реиннервировать близлежащие участки мозга, формируя контакты с нервными клетками реципиентов. Это делает возможным создание новых и реконструкцию поврежденных внутримозговых систем, способных возместить функциональный дефицит. Однако в эмбриональном нейротрансплантате развивается ткань, нетипичная по клеточному составу и соотношению типов нейронов для отдела мозга как донора (в данном случае неокортекса), так и реципиента. Поэтому равноценное возмещение дефекта нервной ткани реципиентов не достигается, так как нетипичные для него клетки устанавливают связи, нехарактерные для данного отдела мозга.
При этом накоплено недостаточно сведений в отношении условий, позитивно сказывающихся на приживлении и развитии эмбрионального нейротрансплантата, и, в итоге, определяющих интеграцию клеточных элементов пересаженной ткани с нейронами мозга реципиентов,  реконструкция которых невозможна без адекватного кровоснабжения. Послеоперационные эффекты нейротрансплантации, реорганизация функциональной биоэлектрической активности трансплантата во многом зависят от восстановления компонентов микрососудистого русла в мозге взрослого животного, а также  определяются уровнем циркуляторно-метаболического обеспечения нейронных популяций, анализ становления которого возможен при оценке поэтапного приживления эмбрионального нейротрансплантата.
Все вышеизложенное послужило основанием для проведения исследования, целью которого явилось изучение динамики локального мозгового кровотока,  сосудистых реакций, а также характера фоновой и вызванной  импульсной активности нейронов эмбрионального нейротрансплантата через 4 месяца после его гомотопической аллотрансплантации в зрительную область коры мозга реципиента. 
МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперименты выполнены на 20 крысах-самцах линии Wistar  массой 180-200 г, распределенных на 2 группы. Первую (основную) группу составили крысы с нейротрансплантатом (n=12). Другая контрольная группа была представлена крысами с интактной зрительной корой (n=8). Крысам основной группы осуществляли аллогенную гомотопическую трансплантацию эмбриональной нервной ткани. Для этого наркотизированных кетамином (12,5 мг/кг, внутрибрюшинно) крыс фиксировали  в стереотаксическом приборе СЭЖ-3, трепанировали кость черепа справа, в области проекции зрительной коры, координаты  которой соответствовали: 3 мм латеральнее лямды; 1 мм ростральнее лямды, глубина - 2 мм (Konig J., Klippel R., 1963),  надрезали твердую мозговую оболочку и с помощью шприца со стеклопластиковым наконечником удаляли 1 мм3  серого вещества, формируя в коре углубление, в которое под микроскопическим контролем помещали донорскую ткань. Затем производили костную аутопластику, ткани головы ушивали.
Донорскую ткань получали от 17-18-дневных эмбрионов, которых после извлечения из матки помещали  в стерильный 5% раствор глюкозы (t=37C). Затем из зоны мозга, соответствующей зрительной коре (Sherwood N. et al., 1970; Altman J. et al., 1995), с помощью шприца со стеклопластиковым наконечником, извлекали фрагмент ткани объемом 1 мм3, используемый в качестве трансплантата.
К исследованию оперированных животных приступали спустя 4 месяца после операции. Голову животного, наркотизированного кетамином (12,5 мг/кг, внутрибрюшинно), фиксировали в стереотаксическом приборе СЭЖ-3. Над областью локализации трансплантанта у крыс основной группы; над зоной проекции зрительной коры у контрольных крыс кость черепа вновь трепанировали. Поверхность мозга покрывали слоем агар-агара и заливали вазелиновым маслом (t = 37º C).
Идентифицировали зрительную проекционную зону в эмбриональном нейротрансплантате и интактной зрительной  коре мозга контрольных крыс путем определения фокуса максимальной активности вызванного потенциала при сенсорной стимуляции (на контралатеральной к оперированному полушарию стороне). Отведение фокальных ответов осуществляли эпидурально от поверхности мозга, монополярно, хлорированными серебряными шариковыми электродами диаметром 200 мкм при полосе пропускания усилителей 1-2000 Гц. Биопотенциалы  регистрировали при помощи электрофизиологической установки УЭФПТ-5. Устанавливали фокус максимальной амплитуды вызванного потенциала, возникавшего с наименьшим латентным периодом.
В идентифицированную зону эмбрионального нейротрансплантата и интактной коры контрольных крыс ступенчато (с шагом 10 мкм) с помощью микроманипулятора погружали блок электродов для синхронной регистрации локального мозгового кровотока и импульсной активности нейронов. Глубину расположения электродов определяли по показаниям микрометрического индикатора КИ-0.01.
 Локальный мозговой  кровоток регистрировали  с использованием метода полярографического  определения  рН2 при электрохимической генерации водорода непосредственно в мозговую ткань (Stosseck K., 1974). При этом диаметр платинового электрода генерации водорода составлял 30 мкм, а измерительного электрода  10 мкм. Хлорсеребряные электроды сравнения для цепи измерения рН2, а также референтный платиновый электрод для цепи генерации водорода помещали под кожу животного в области шеи.   Для регистрации локального мозгового  кровотока использовали  прибор «Физиоблок-01», выход которого соединяли с компьютером через аналого-цифровой преобразователь  L152.  Сигналы от электродов усиливали биоусилителем и записывали на жесткий магнитный диск компьютера, производили  расчет количественных характеристик показателя. Анализировали латентные периоды развития микрососудистых реакций и их амплитуду (% прироста величины показателя относительно его исходного уровня).
Импульсную активность отводили на глубине 0,4-0,7 мм от поверхности мозга посредством стеклянных микроэлектродов с капиллярами (диаметр кончика 2-4 мкм, сопротивление 15-20 мОм), заполненными 0,9% раствором NaCl. Частота дискретизации сигнала была 10 кГц.  Зарегистрирована импульсная активность 38 нейронов трансплантата, а также 27 нейронов контрольной зрительной коры.
При исследовании характера развития гемодинамических реакций в эмбриональном нейротрансплантате и зрительной коре контрольных крыс, а также импульсной активности нейронов в период  ответной реакции на стимуляцию в качестве адекватного сенсорного стимула применяли световое воздействие (близкое по спектру к белому), которое осуществляли с помощью  фотостимулятора - лампы,  размещенной на расстоянии 0,3-0,5 м от глаз крысы. Параметры: длительность 150 мкс, интенсивность 0,2-0,6 Дж, в течение 10 с, перерывы между сериями составили 10-20 с.  Для каждого нейрона записывали по 10-12  таких серий.
По окончании опытов производили  микроскопирование трансплантата с визуализацией треков электродов. В каждой точке регистрации делали проходку микроэлектродом, окрашенным тушью, до заданной глубины. Животное подвергали эвтаназии введением большой дозы кетамина, череп вскрывали, визуально оценивали размеры трансплантатов, микроскопически (микроскоп МБИ-1, ок.7, об.3,5) производили верификацию местонахождения треков микроэлектродов. Учитывали записи импульсной активности нейронов, которые были сделаны в пределах трансплантата.
Для анализа цифровых записей нейронной активности применяли компьютерные программы, позволявшие выделять  импульсные потоки отдельных нейронов на основании идентификации их спайков по амплитуде, длительности, соотношению позитивного и негативного компонентов импульса. После выделения и децимации записи представляли собой последовательности межимпульсных интервалов с разрешением по времени 1 мс.  Статистический анализ полученных результатов производили с помощью программы Statistica 5.0. Оценивали значения средней частоты импульсной активности нейронов, продолжительности и дисперсии межимпульсных интервалов с построением гистограмм плотности вероятности их распределения с периодом усреднения  4 или 8 мс, суммарное количество усреднений составляло 2000. Для определения значимости различий между выборками использовали t-критерий Стьюдента для независимых выборок.
РЕЗУЛЬТАТЫ  ИССЛЕДОВАНИЯ
Результаты измерения локального мозгового кровотока в эмбриональном нейротрансплантате показали, что при ступенчатом погружении электрода его значения варьировали в диапазоне от 26-69 мл/100г/мин. Наибольшие значения кровотока регистрировались  на глубине  0,5-0,7 мм.  Гистограмма распределения величин локального мозгового кровотока имела близкую к симметричной форму, модальный класс значений соответствовал 45-50 мл/100г/мин. Интенсивность кровотока  в  эмбриональном нейротрансплантате составила  в среднем  42,9±2.3 мл/100г/мин.
У контрольных крыс в зрительной коре величины кровотока варьировали по глубине коры от 35 до 81 мл/100г/мин, а максимальные его значения были зарегистрированы на глубине 0,6-0,8 мм. Гистограмма распределения показателей имела близкую к симметричной форму, мода значений находилась в диапазоне  55-60 мл/100г/мин. Интенсивность кровотока составила в среднем 55,9±1,9 мл/100г/мин.
Таким образом, через 4 месяца после пересадки объемная скорость кровотока в эмбриональном нейротрансплантате была снижена по сравнению с контролем на 23,2% (р<0,05).
   Регистрация динамики локального кровотока в нейротрансплантате и зрительной коре контрольных крыс выявила, что  в ответ на сенсорное раздражение в идентифицированной зоне регистрации  наблюдались отчетливые реакции в виде увеличения кровотока, значения которых постепенно восстанавливались до близких к исходному уровню только после окончания воздействия. Очевидно, что зарегистрированные изменения отражали формирование локальной функциональной гиперемии, развивающейся посредством местных сосудистых реакций. 
При адекватной сенсорной стимуляции уровень интенсивности локального мозгового  кровотока в эмбриональном нейротрансплантате возрастал с латентным периодом 5,1±0,8 с и амплитудой, соответствовавшей 15,4±1,6 %. Латентный период реакции постстимуляционного повышения  кровотока в  исследуемой зоне зрительной коры контрольных крыс составил  6,4±2,6 с, а ее амплитуда  8,45±4,8%.
Таким образом, анализ пространственно-временных характеристик микрососудистых реакций в эмбриональном нейротрансплантате и в контрольной зрительной коре не выявил статистически значимых различий продолжительности их латентных периодов. В то же время в нейротрансплантате прирост локального мозгового кровотока составил в 1,8 раза большую (р0,01) величину, чем у контрольных животных.
Результаты данной серии экспериментов, выявившие развитие в эмбриональном нейротрансплантате повышенного уровня локальной функциональной гиперемии в ответ на сенсорную стимуляцию, могут свидетельствовать о повышенной дилататорной способности микрососудов при осуществлении ими регуляторных адаптивных реакций, компенсирующих снижение исходной величины  мозгового кровотока.
В эмбриональном нейротрансплантате фоновой импульсной  активностью обладали 74% нейронов. При этом среди них были выявлены три популяции клеток, первая из которых (17%) была представлена высокочастотными нейронами, генерировавшими импульсную активность с частотой 21-35 имп/с;  вторая (67%) – среднечастотными (7-20 имп/с) и третья (16%) – низкочастотными (1-6 имп/с) нейронами. Текущая средняя частота импульсной активности клеток нейротрансплантата составила 4,7±0,75 имп/с.
В зрительной коре контрольных крыс выявлено 89% фоновоактивных клеток, среди которых было зарегистрировано 9% высокочастотных, 72% среднечастотных и 19% низкочастотных нейронов. Текущая средняя частота генерации импульсов равнялась 13,7±2,52 имп/с и была выше (р<0,01), чем в нейротрансплантате.
В фоновой активности клеток трансплантата доминировал непрерывно-аритмический тип импульсации, составивший 58%. В 19% случаев был выявлен смешанный, в 14% – пачечно-групповой и в 8%  – пачечный тип генерации импульсов. В клеточных популяциях контрольной коры преобладали непрерывно-аритмический (75%) тип фоновой импульсной активности, в 19% случаев был выявлен смешанный,  в 4% – пачечно-групповой и 2% - пачечный тип.
Таким образом, из полученных результатов следует, что через 4 месяца после трансплантации фоновая импульсная активность эмбриональной нервной ткани характеризовалась качественным сходством с функциональными свойствами нейронов зрительной коры контрольных крыс. Вместе с тем были обнаружены различия в количественных характеристиках импульсного потока, что нашло отражение в снижении средней текущей частоты импульсной активности клеток нейротрансплантата.
Анализ вызванной активности нейронов показал, что из 38 зарегистрированных клеток  трансплантата отреагировали на фотостимуляцию 27 нейронов (71%), из числа которых 7 нейронов относились к фоновомолчащим, а 20 – к фоновоактивным. При этом  установлено, что 74% клеток отвечали развитием возбудительной реакции в виде увеличения частоты генерации импульсов. Для 7% нейронов явилось характерным чередование периодов учащения и урежения  импульсации, а у  19% нейронов в ответ на сенсорную стимуляцию отмечено начальное снижение частоты генерации импульсов с последующим ее восстановлением до первоначального уровня. Текущая средняя частота вызванной импульсной активности клеток нейротрансплантата составила 12,5±1,9 имп/с, что было почти на 65% больше (р<0,01) по сравнению с их фоновой активностью.
В контрольной коре из 27 зарегистрированных клеток   на фотостимуляцию отреагировали  24 нейрона (89%), среди которых 5 нейронов относились к фоновомолчащим, а 19 – к фоновоактивным. Из общего числа активированных стимуляцией клеток 87% нейронов отвечали возбуждением, повышая частоту генерации импульсов. У 10% нейронов выявлено  наличие чередования периодов активации и угасания импульсации, у 3% клеток – начальное снижение импульсной активности с последующим восстановлением ее уровня до первоначального значения. Реагировавшие  на сенсорную стимуляцию нейроны зрительной коры отвечали на все поданные стимулы. Текущая средняя частота вызванной активности нейронов у контрольных крыс возросла до 21,1±3,65 имп/с, что было на 35% больше (р<0,05) по сравнению с фоновой активностью.
Итак, в результате проведенного исследования показано, что в паттернах вызванной импульсной активности  клеток нейротрансплантата наблюдались реакции, характерные для нейронов зрительной коры контрольных крыс, а именно: увеличение средней частоты импульсной активности, появление импульсных разрядов и тормозных фаз, коррелирующих с моментом нанесения стимулов. 
Таким образом нами получены данные, позволяющие считать, что спустя 4 месяца после трансплантации эмбриональной нервной ткани, клетки нейротрансплантата, развивающегося в коре мозга реципиента, обладают адекватным  циркуляторно-метаболическим обеспечением, а питающая их микрососудистая сеть проявляет способность к осуществлению активных сосудистых реакций, направленных на регулирование кровотока в соответствии с метаболическими потребностями нервной ткани.