Омский государственный педагогический университет

Эта работа опубликована в сборнике научных трудов «Естествознание и гуманизм» (2006 год, Том 3, выпуск 1), под редакцией проф., д.б.н. Ильинских Н.Н. Посмотреть титульный лист сборника

Эволюционные преобразования тканей у животных в сравнительном ряду позвоночных происходят параллельно, при дивергентном развитии организмов с изменением функционально - аналогичных тканей в одном, для всех групп животных, направлении [3]. Печень, являясь полифункциональным органом, выявляет особенности филогенетического развития - по пути функциональной аналогии. Одной из главных функций является функция детоксикации, другие проявляются в той или иной степени выраженности, что определяется уровнем организации организма, средой обитания, системой терморегуляции и степенью перераспределения функциональной нагруженности органов  в системе организма. Межвидовые различия в клеточной теплоустойчивости находятся в соответствии с различиями в температуре обитания видов [2]. Причина неослабевающего интереса к этому органу заключается в его полифункциональности и формировании сложных структурно - метаболических реакций, что обеспечивает выживаемость биологических систем при действии различных эндогенных и экзогенных повреждающих факторов [1, 14, 16]. Среди экстремальных абиотических факторов особое место принадлежит гипертермии. Общее перегревание организма происходит в естественных, производственных и экспериментальных условиях; этот фактор вот уже на протяжении 20 лет используется в комплексной терапии для стабилизации очага трансформированных клеток [15]. В связи с этим целью нашего исследования является выявить характерные для исследуемых видов млекопитающих и рыб изменения в ультраструктуре гепатоцитов после воздействия гипертермии, определяемые эволюционным положением и экологической специализацией.
Эксперимент поставлен на двух группах животных: млекопитающие - вид Muridae Rattus norvegicus (половозрелые беспородные крысы самцы 2 месяцев постнатального развития); рыбы вид - Carassiuus aurata gibelio (двухлетки – 2+). В эксперименте участвовало по 30 особей в каждой группе (15 служили контролем). Термальное воздействие на организм крыс проводили в воздуховентилируемой камере в течение 20-30 минут с термостатированием температуры 42ºС. Перегревание рыб проводили в принудительном статичном терморежиме в условиях свободного плавания в термоградиентном лотке с дополнительной аэрацией [7]. Осцилляция температуры осуществлялась в диапазоне 32°С, в течение 20 минут. Животных взвешивали индивидуально на электронных весах WA33 в начале и конце опытов. Ректальную температуру измеряли с помощью электротермометра ТЭП-16. Декапитацию проводили через час после воздействия. Температурное воздействие, применяемые в эксперименте, на 1-2°С выходят за пределы биологического оптимума изучаемых видов животных, в связи с чем моделировался тепловой шок средней тяжести.
Материалы и методы исследования:
Для морфологических исследований образцы печени фиксировали погружением в 4% растворе параформа на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,4) с добавлением сахарозы (5%). Для проведения электронномикроскопического исследования материал дофиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия в течение 2 часов и плоскопараллельно заливали в смесь эпон-аралдит. Ультратонкие срезы контрастировали уранилацетатом, цитратом свинца. Просмотр и фотографирование ультратонких срезов производили на электронном микроскопе “Hitachi-600H”. Определение объемной плотности, поверхностной плотности и численной плотности изучаемых структур проводили на сканированных электроннограммах с использованием программы UTHSCSA ImageTool 3.0. Количественные параметры оценивалась на единицу площади (100 мкм2) паренхимы печени. Статистическую обработку полученного материала осуществляли с помощью пакета прикладных программ ”STATISTICA-5” [10]. Различия между независимыми выборками определяли с помощью критерия Манн-Уитни (U) Р≤0,05.
Собственные данные
Рыбы. Ультраструктурная организация гепатоцитов различных видов рыб обусловлена положением в зоолого - таксономической, эколого - физиологической классификации, а так же типом питания [9]. Карась вида Carassiuus aurata gibelio относится к растительноядным эврибионтам, в связи с чем имеет высокую степень адаптации к различным температурным режимам, кислородному градиенту воды.
После перегревания просветляется цитоплазматический матрикс гепатоцитов. Что отражает нарушение белкового синтеза, проникновение в цитоплазму воды, в следствие увеличения проницаемости плазматической мембраны. В ядре увеличивается объемная плотность гетерохроматина (0,02±0,008 и 0,08±0,02 мкм3/мкм3 соответственно). В процессе конденсации хроматин в ядре занимает маргинальное расположение в виде глыбок различных размеров, что отражает активацию процессов гликолиза и инактивацию транскрипционно активных участков ДНК. В то же время активируются процессы глюконеогенеза, что отражается в  увеличении объемной плотности гликогена в цитоплазме гепатоцитов с 0,03±0,008 до 0,09±0,004 мкм3/мкм3. Конденсирование нитей хроматина может быть вызвано повышенной активностью ДНК-азы и лизосомальных катепсинов. Это, в свою очередь, проявляется в увеличении объемной плотности гетерохроматина. Меняется форма ядра, перинуклеарное пространство расширяется.
После перегревания нарушается структура митохондрий, что проявляется в различной их реакции на действие гипертермии. Часть митохондрий проявляет признаки набухания, просветления матрикса, с увеличением объемной (0,1±0,07 и 0,4±0,04 мкм3/мкм3 соответственно) и поверхностной плотности (3,8±0,3 и 5,6±0,8 мкм2 /мкм3 соответственно). Что может быть обусловлено усилением обменных процессов в печени в связи с повышенным функциональным запросом который, предъявляется к печени в условиях теплового стресса как к основному метаболическому центру организма. Другая часть митохондрий проявялет конденсированную конфигурацию – матрикс уплотнен, кристы расширены, что указывает на нарушение отвода электронов от митохондрий для использования во внутриклеточном метаболизме. Снижается численная плотность митохондрий с 5,9±1,2 до 3,0±0,9 мкм0/мкм3. Набухание митохондрий - это один из признаков разобщения процессов окисления и фосфорилирования, вызванного гипоксией, которая, в свою очередь, опосредована действием гипертермии. После действия термального стресса снижается количество митохондрий, находящихся в тесном топографическом контакте с каналами ГЭС, что отражает снижение белковосинтетической деятельности гепатоцитов. После перегревания уменьшается число стопок ГЭС, который разбивается на везикулы, отдельные полости, радиально расходящиеся от ядра. Наблюдается процесс сужения полостей ГЭС и потеря прикрепленных к мембране рибосом. Снижается объемная плотность АЭС – 0,2±0,06 и 0,04±0,03 мкм3/мкм3 соответственно. В цитоплазме отмечено снижение объемной плотности лизосом с 0,03±0,01 до 0,01±0,004 мкм3/мкм3 и увеличивается объемная плотность гликогена с 0,03±0,008 до 0,09±0,004 мкм3/ мкм3.
Млекопитающие. После перегревания цитоплазма гепатоцитов уплотнена. Мощный пакет гранулярного эндоплазматического ретикулума тесно ассоциирован с ядром. Его каналы удлинены, их четкообразное расширение может демонстрировать активацию синтеза белка. Гиперплазия удлиненных каналов гранулярного эндоплазматического ретикулума в гепатоцитах может быть следствием влияния повышенного уровня БТШ [17] в результате свободнорадикального повреждения эндотелия синусоидальной выстилки. Увеличивается объемная плотность ГЭС с 0,2±0,07 в контроле до 0,4±0,07 мкм3/мкм3 в эксперименте. В расширенных диктиосомах и вакуолях комплекса Гольджи выявляются липопротеиновые частицы, вероятно, ввиду задержки их транспорта. Митохондрии проявляют тесный топографический контакт с липидными каплями. Матрикс митохондрий уплотнен, в отличие от рыб, снижается объемная (0,3±0,07 и 0,2±0,03 мкм3 /мкм3  в эксперименте) и поверхностная (8,2±1,4 в контроле и 6,3±0,3 мкм2 /мкм3 после перегревания) плотность митохондрий. Со стороны АЭС выявляется гиперплазия каналов в перинуклеарной зоне гепатоцитов с повреждением мембран и возникновением очага гидратации. Увеличивается объемная плотность гетерохроматина в ядре с 0,2±0,05 до 0,3±0,02 мкм3/мкм3 и снижается объемная плотность ядрышка (0,2±0,02 и 0,1±0,0 мкм3/мкм3 соответственно), что характеризует затухание матричных синтезов. Перестройка гетерохроматина осуществляется в соответствии с потребностями синтеза РНК и белка, обеспечивая согласование уровней транскрипции и трансляции. Изменение структуры хроматина и ядерного матрикса как следствие повреждения ДНК, включая разрывы и модификации оснований после гипертермии – физиологического агента, вызывающего стресс [13], в свою очередь, могут быть эндогенными индукторами апоптоза. Выявляется почкование липидных капель в цитоплазме как признак начала жировой дистрофии в отдельных гепатоцитах. Увеличивается объемная плотность лизосом (0,02±0,001 и 0,03±0,0мкм3/мкм3 соответственно), объемная (0,04±0,05 и 0,1±0,0  мкм3/мкм3  соответственно) и поверхностная плотность (6,4±0,0 и 12,9±2,0  мкм2 /мкм3 соответственно) липидных капель. Предполагается, что продукты лизосомального протеолиза при дефиците источников энергии могут быть использованы для энергетических и пластических потребностей клеток, в чем выражается сущность «реконструктивной функции» лизосом [14]. Наличие липофусцина, гемолиз эритроцитов – свидетельство окислительного стресса, который развивается после гипертермии. При этом снижается антиоксидантная защита в гепатоцитах, угнетается функционирование комплекса Гольджи.
Таким образом, выявлены как сходства в реактивных изменениях ультраструктуры гепатоцитов рыб и млекопитающих, так и отличия. В частности, общей реакцией является конденсация хроматина в ядрах гепатоцитов. Остальные показатели проявляют межвидовые отличия – у рыб увеличиваются, а у млекопитающих снижаются объемная и поверхностная плотность митохондрий; со стороны лизосом наоборот - увеличивается объемная и поверхностная площадь у млекопитающих и снижается у рыб. После гипертермии выявлено увеличение объемной плотности гликогена в группе рыб, у млекопитающих - липидов. В гепатоцитах рыб снижается объемная плотность АЭС, что является показателем угнетения процессов детоксикации. В свою очередь у млекопитающих отмечается увеличение объемной плотности ГЭС. Т.о. в группе рыб отмечено доминирование анаболических процессов, на что указывает высокое содержание гликогена, тогда как в группе млекопитающих доминируют катаболические процессы, это проявляется в снижение содержания гликогена и увеличении показателей лизосомальных структур.
Заключение
Проблема эволюционных преобразований и приспособительных особенностей клеток органов входит в число важнейших вопросов биологической науки, являясь составной частью фундаментальных исследований эволюции и адаптации организма животных в различных условиях среды.
Так, в частности, полиморфизм митохондрий связан с тем, что органеллы активно меняют свою форму для увеличения контакта с немногочисленными цистернами ГЭС, в результате чего наиболее полно при существующих в клетке возможностях осуществляется синтез белков, подлежащих выведению из клетки. Различия в ультраструктуре наблюдались от клетки к клетке и даже среди органелл в одной и той же клетке, что подтверждает на ультраструктурном уровне действие закона перемежающейся активности функционирующих структур [6, 12]. Учитывая различный временной период функционирования органелл гепатоцитов, в частности митохондрий, они могут отражать наличие в клетках широкого спектра танатогенных подпрограмм [8], которые реализуются в отдельных  гепатоцитах в ответ на действие термального стресса.
Перемежающееся функционирование однотипных структур включается на определенном этапе развития органа в соответствии с функциональной нагрузкой. Компенсаторной реакцией является обилие липидных капель, видимо, поступающих из жировых депо для их метаболизма в качестве энергетического субстрата. Увеличение гликогена выявленное у рыб является следствием преобладания процессов гликонеогенеза над процессами гликогенолиза. Т.е. в данной группе пойкилотермных животных увеличивается значение гликогена, как источника энергетического субстрата в период первичной тепловой устойчивости после воздействия гипертермии. Отмечен значительный полиморфизм гепатоцитов, отражающий разную степень их реакции на гипертермию, что связано с различным ритмом их функционирования, а следовательно - и степенью адаптации к нагрузке.
Увеличение количества цистерн ГЭС, размеров, количества митохондрий, гипертрофия и гиперплазия комплекса Гольджи выявляют наличие внутриклеточной физиологической регенерации [11]. Тесный топографический контакт митохондрий с липидными каплями указывает на течение АТФ-зависимого процесса β-окисления жирных кислот липидов с помощью ферментов митохондрий [4]. Большое количество вторичных лизосом тоже следует рассматривать как компенсаторную реакцию, так как с ними удаляются в желчный капилляр трансформированные продукты жизнедеятельности клеток. Отмечено тесное топографическое взаиморасположение с митохондриями капель липидов и липофусцина, что отражает наличие окислительного стресса, угнетение активности ферментов цикла трикарбоновых кислот и взаимосвязь митохондрий с процессами липогенеза.
Полученные данные выявили на ультраструктурном уровне приспособительное значение морфологических особенностей клеток печени, их взаимоотношение с функцией и со средой в процессе эволюции и подтвердили высказывания А.Н. Северцова, что «все эволюционные изменения животных происходят в прямой или косвенной зависимости от изменений окружающей среды», «вся организация животных во всякий период эволюции является адаптивной». 

Литература:
1.    Алматова К.Т., Мусоев Х.Н., Кадирова З.Х. О фосфолипидном составе мембран митохондрий печени при тепловых стрессах//Вопр. мед. химии.-1994.-№2.-С.48-52.
2.    Александров Александров В.Я., Кислюк И.М. // Цитология. 1994. № 1. С. 5-43. Реакция клеток на тепловой шок: физиологический аспект
3.    Заварзин А.А. Труды по теории параллелизма и эволюционной динамике тканей. Л-д. «Наука». 1986. 194с.
4.    Калашникова М.М. Особенности морфологической дифференцировки гепатоцитов различных животных в онтогенезе в зависимости от характера питания // Бюлл. экспер. биол. 1997. Т. 122. N1. С.4-10.
5.    Коун К, Сарджент Док. Питание, //в кн «.Биоэнергетика и рост рыб», пер с англ. М. «Легкая и пищевая промышленность». 1983. С.8-61.
6.    Крыжановский Г.Н. Биоритмы и закон структурно-функциональной временной дискретности биологических процессов. // В кн.: Биологические ритмы в механизмах компенсации нарушенных функций. М. 1973. С.20-34.
7.    Константинов А.С., Зданович В.В., Пушкарь В.Я. Энергобюджет карпа CYPRINUS CARPIO и золотой рыбки CARASSIUS AURATUS в оптимальных стационарных и переменных терморежимах // ВЕСТН. МОСК. УН-ТА. СЕР. 16. БИОЛОГИЯ. 2005. - № 1  c. 39-44
8.    Проскуряков С.Я. Некроз – активная форма программируемой клеточной гибели // Биохимия Т.67, вып 4. 2002. с. 468-487
9.    Руднева И.И. Эколого-физиологические особенности антиоксидантной системы рыб и процессов перикисного окисления липидов // Успехи соврем.биол. 2003.-Т.123, №4, С.-391-400.
10.    Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. М., МедиаСфера, 2002.–305c.
11.    Саркисов Д.С. О формах внутриклеточной регенерации./Арх.пат. 1970. В. 1. С.40-45.
12.    Саркисов Д.С. Ультраструктурные основы биоритмов и проблема гомеостаза / В кн. Биологические ритмы в механизмах компенсации нарушенных функций. М. 1973. С. 35-46.
13.    Тронов В. А., Е. М. Константинов, И. И. Крамаренко Сигнал к апоптозу, индуцированный гипертермией, и пути его передачи в клетке // Цитология.-2002, Т. 44, №11.- с. С.1079-1087
14.    Шкурупий В.А. Ультраструткура клеток печени при стрессе. Новосибирск: Наука. Сиб.отд-ние, 1989.-144с.
15.    Ademeyiva O., Adesanya O., Ajuwon O.R. Vitamin C in hepatokxidy. A preliminary report // Hum. and Exp. Toxticol. 1994. 13,N2.p.107-109.
16.    Harari P.M., Fuller D. J., Carper S.W., Groghan M.K., Meyscens F.L., Shimm D.S., Gerner E.W. Poliamine biosyntesise ihibithors combined with systemic hupervermia in cancer therapy// Int. J.Radiat. Oncol.Biol. Phis.-1990.-vol.19.,N1.-p.89-96.
17.    Jarnagin W., Rockey D., Kotelinsky V. Expression of variant fibronectins in wound healing: cellular source and biological activity of the EШA segment in rat hepatic fibrogenesis // J. Cell. Biol., 1994.- 127.- № 6.- H.2037-2048.