Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск

Основной проблемой лечения онкологических больных являются побочные эффекты химиотерапии с помощью лекарственных средств. В результате их системного введения лишь менее одного процента препаратов достигает цели (раковых клеток), тогда как основная часть поражает здоровые ткани организма. Таким образом, разработка новых методов целевой доставки лекарственных средств для лечения онкологических больных является одним из приоритетных направлений биотехнологии последнего десятилетия. В свою очередь, недавний прорыв в области нанотехнологий открывает новые возможности для решения этой проблемы и предполагает тесное сотрудничество ученых на стыке материаловедения и биомедицины. Целью данной работы, осуществленной на базе Jozef Stefan Institute, Любляна, Словения в рамках сотрудничества с Кафедрой биохимии и молекулярной биологии СибГМУ, являлось исследование возможности использования бионанокомпозиций «наночастицы-стефины» в системах целевой доставки лекарственных средств на основе наночастиц с магнитными свойствами для диагностики и лечения раковых заболеваний.
Известно 11 цистеиновых катепсинов человека, которые в норме играют роль эндопептидаз в лизосомах [5]. Было установлено, что катепсины принимают важное участие в опухолевом росте и метастазировании [1, 2, 3]. В целом ряде опухолевых заболеваний отмечается дисрегуляция и резкое увеличение уровня цистеиновых катепсинов. Катепсины секретированные вне клетки и ассоциированные с клеточной мембраной раковых клеток участвуют в протеолизе белков межклеточного матрикса в здоровых тканях, окружающих опухоль. Наибольшая активность катепсинов отмечается по периферии опухоли, что способствует ее агрессивному росту, неоплазии и метастазированию [2, 3]. Установлено, что повышенный уровень цистеиновых катепсинов является плохим прогностическим фактором при опухолевых заболеваниях.
В регуляции протеолитической активности катепсинов участвуют стефины – конкурентные эндогенные белковые ингибиторы цистеиновых катепсинов. Это одноцепочечные белки размером ~ 100 аминокислот (11 kDa), экспрессируются в различных тканях млекопитающих, установлена их внутри- и внеклеточная локализация [4]. У млекопитающих выделяют 2 формы стефинов – Стефины А и B. При развитии раковых заболеваний отмечается резкое увеличение уровня цистеиновых катепсинов и снижение уровня их ингибиторов – стефинов, что приводит к дисрегуляции протеолитической активности катепсинов и способствует агрессивному опухолевому росту и метастазированию. Восстановить нарушенный баланс и подавить развитие злокачественного процесса можно, использовав целевую доставку рекомбинантных стефинов в очаг опухолевого роста.
В ходе работы была проведена экспрессия, выделение и очистка рекомбинантных стефинов человека. Гены человеческого стефина А и 2х мутантных форм стефина B (S3Y31 и S3E31) были клонированы в экспрессионный вектор pET-3a. Экспрессия 3х рекомбинантных ингибиторов осуществлялась в системе E. coli (линия BL21 pLysS). Выделение и очистка белков проводились с помощью метода гель-фильтрации на хроматографической колонке с Sephacryl-200 и аффинной хроматографии на хроматографической колонке с карбоксиметил-папаин сефарозой. Было выделено и очищено около 300 мг рекомбинантного белка. Далее был проведен анализ полученных рекомбинантных стефинов человека методами аналитической гель-фильтрации (AKTA FPLC) и Native-PAGE. Было установлено, что стефин А не олигомеризуется, в то время как мутантные формы стефина B формируют неактивные димеры и тетрамеры. Кроме того, было показано, что мономерная фракция стефина B S3Y31 крайне нестабильна и происходит постоянная ее димеризация. Поэтому дальнейшие исследования были сконцентрированы на рекомбинантном стефине А и стефине B S3Е31. Была проведена оценка их ингибиторной активности с помощью цистеинового катепсина В. Изучение кинетики связывания рекомбинантных ингибиторов с активным центром катепсина В выполнялось с помощью флюорометрии на монохроматоре Tecan Safire (Tecan Group Ltd.). Среднее значение ингибиторной активности стефина А составило 48%, мономерной фракции стефина В S3E31 – лишь 10%. Таким образом, при создании бионанокомпозиций «наночастицы-стефины» для целевой доставки наиболее перспективным является использование рекомбинантного стефина А, поскольку он стабилен, не олигомеризуется и отличается наибольшей ингибиторной активностью.
Заключительным этапом проведенной работы являлась оценка ингибиторной активности полученного рекомбинантного стефина А человека с помощью цистеинового катепсина В в присутствии наночастиц Cu, Fe, LiFe5O8, Ni, Fe3O4, SnO2, MgFe2O4. Используемые в работе порошки наночастиц образуют агломераты до нескольких мкм, что делает невозможным их применение для поставленных задач. С целью дезинтеграции агломератов и стабилизации наночастиц нами был использован стабилизирующий буфер на основе цитрата натрия и ультразвуковая дезинтеграция с последующим центрифугированием. Анализ ингибиторной активности показал, что наночастицы Cu, Fe, LiFe5O8 инактивируют катепсин В. В свою очередь, Ni, Fe3O4, SnO2, MgFe2O4 не влияют на ингибиторную активность рекомбинантного стефина А по отношению к катепсину В и поэтому могут быть использованы при создании бионанокомпозиций «наночастицы-стефины» для целевой доставки в опухолевый очаг.
Таким образом, в ходе работы показана принципиальная возможность использования бионанокомпозиций «наночастицы-стефины» для разработки систем целевой доставки лекарственных средств с целью диагностики и лечения раковых заболеваний.

Список литературы:
13.    Cathepsin B and D are localized at the surface of human breast cancer cells / M. Sameni, E. Elliot, G. Ziegler et al. // Pathol Oncol Res. – 1995. – Vol. 1, №1. P. 43-53.
14.    Cathepsin B and tumor proteolysis: contribution of the tumor microenvironment / B. F. Sloane, S. Yan, I. Podgorski et al. // Seminars in Cancer Biology. – 2005. – Vol. 15. – P. 149-157.
15.    Pericellular cathepsin B and malignant progression / S. Roshy, B. F. Sloane, K. Moin // Cancer and Metastasis Reviews. –2003. – Vol. 22. – P. 271-286.
16.    Turk, B. Structural and functional aspects of papain-like cysteine proteinases and their protein inhibitors / B. Turk, V. Turk, D. Turk // Biol Chem. – 1997. – Vol. 37. – P. 141-150.
17.    Turk, V. Lysosomal cysteine proteases: facts and opportunities / V. Turk, B. Turk, D. Turk. // J. Embo. – 2001. – Vol. 20. – P. 4629-4633.