Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН, Новосибирск

Методы культивирования клеток печени заслуженно находят широкое применение при различного рода исследованиях, позволяя решать многие прикладные и фундаментальные задачи [1; 2; 3]. Однако при всем многообразии технических подходов [1; 2; 3; 4] остается весьма актуальная проблема, связанная со сложностью выделения и культивирования клеток. Так как необходимость оптимизации и упрощения методов культивирования клеток печени по-прежнему существует, то это мотивирует поиск новых эффективных способов решения вопроса.
Предлагаемый метод создания тканевой культуры из фрагментов ткани печени состоит в следующем: 1. После выделения печени, орган разделяется скальпелем на 10 частей в чашке Петри, содержащей среду 199 с 10% эмбриональной телячьей сыворотки; 2. Проводиться отмывка этих фрагментов от крови; 3. Далее каждую из этих частей (или несколько в зависимости от необходимого объема посадки) подвергают механической фрагментации, таким образом, чтобы размеры фрагментов не превышали 0,5 куб. мм. (это позволяет компонентам культуральной среды эффективно диффундировать вглубь фрагмента, и тем самым обеспечивать клеткам адекватные условия инкубации); 4. После трехкратной отмывки в свежих порциях культуральной среды (состав которой указан выше) фрагменты переносятся в лунки культурального планшета или во флаконы для культивирования клеток, предварительно содержащие 1,5 мл среды (того же состава); 5. Клетки инкубируют в условиях влажной камеры при содержании 5% СО2, экспозицию осуществляют при 37 С в течении 24-72 часов; 6. По истечении сроков инкубации фрагменты извлекают из культуральной посуды и помещают на предметное стекло в 20 мкл среды (того же состава), и покрывают покровным стеклом (умеренно придавливая); 7. Проводят анализ морфо-функционального состояния клеток методами световой и флюоресцентной микроскопии. Возможна также предварительная фиксация препаратов и их окраска гематологическими красителями.
Данный метод имеет значительные преимущества по сравнению с известными аналогами, среди которых следует выделить: 1. эксплантацию клеток печени из фрагмента ткани; 2. ферментативную диссоциацию ткани печени (с помощью коллагеназы), в том числе с использованием перфузии органа.
Это объясняется тем, что предлагаемый метод позволяет культивировать клетки в условиях естественного для них микроокружения, не нарушая архитектонику ткани, что в противном случае крайне негативно сказывается на морфо-функциональном состоянии клеток и влияет на достоверность результатов исследования. Особенно это касается метода ферментативной обработки ткани, нередко приводящего к некротическим изменениям клеток, и требующим неоднократного и тщательного подбора режимов экспозиции с ферментом при условиях строгого соблюдения правил асептики и антисептики.
Не последнюю роль играет техническая простота и дешевизна предлагаемого метода по сравнению с имеющимися аналогами, поскольку он не требует для своего осуществления дорогостоящего оборудования и реактивов. Особенно очевидны экономические преимущества данного метода при его сравнении с классическим методом приготовления гистологических препаратов, реализация которого невозможна без наличия хорошо оснащенной гистологической лаборатории и участия высококвалифицированного лаборанта.
Предлагаемый метод позволяет приготовить 50-70 препаратов из ткани органа (печени) только одного животного (мыши). Это дает то преимущество, что значительно экономится время, а также используется ткань одного и того же органа для приготовления всех препаратов как контрольных, так и экспериментальных групп культур, что способствует сопоставимости результатов исследования, и многократному уменьшению количества требующихся животных.
Последний факт также позволяет говорить о высокой экономической целесообразности настоящего метода, поскольку суммарная стоимость животных и расходы на их содержание значительно сокращаются.
К недостаткам метода можно отнести необходимость соблюдения указанных размеров фрагментов ткани при ее измельчении, что, однако, устраняется довольно быстрым приобретением соответствующих навыков.
Список литературы:
1. Brill S., Zvibel I., Reid L.M. Expansion conditions for early hepatic progenitor cells from embryonal and neonatal rat livers // Dig. Dis. Sci. - 1999. - V. 44. - № 2. - P. 364-371.
2. Mukwena N.T., Al-Rubeai M. Apoptosis and its suppression in hepatocytes culture // Cytotechnology. - 2004. - V. 46. - № 2-3. - P. 79-95.
3. Spotorno V.G., Hidalgo A., Barbich M., Lorenti A., Zabal O. Culture of bovine hepatocytes: a non-perfusion technique for cell isolation // Cytotechnology. - 2006. - V. 51. - № 2. - P. 51-56.
4. Sun Y., Oberley L.W., Oberley T.D., Elwell J.H., Sierra-Rivera E. Lowered antioxidant enzymes in spontaneously transformed embryonic mouse liver cells in culture // Carcinogenesis. - 1993. - V. 14. - № 7. - P. 1457-1463.