ФГУ «Нижегородский НИИ травматологии и ортопедии» Минзравсоцразвития России (г. Нижний Новгород)

Эта статья опубликована сборнике научных трудов "Проблемы и перспективы современной науки" с материалами Четвертой Международной Телеконференции "Фундаментальные науки и практика" - Том 3 - №1. - Томск - 2011.

 

Клеточные культуры продолжают оставаться одной из простейших и чрезвычайно информативных моделей, позволяющих изучать развитие клеток различного происхождения, их взаимодействие друг с другом, воздействие на них различных медикаментозных средств и факторов.
Целью настоящего исследования было изучение особенностей функционирования фибробластов различного генеза на модели in vitro и изменение их под воздействием ЭМИ КВЧ.
Материалом для исследования стали 6 культур фибробластов, полученных из биоптатов неизмененной кожи, 5 культур фибробласов рубцово-измененной кожи, 5 – из кожи псориатических очагов. Культуры получали по стандартной технологии в условиях абсолютной влажности, 37ºС, 5% СО2. Для исследования использовали культуры 4-6 пассажа с исходной концентрацией 20000 клеток на 1см2 (лунка культурального планшета). Для исследования каждая культура высевалась в шесть лунок (по три опытные лунки и три контрольные) через 24 и 48часов, и по три лунки на каждый последующий день исследования. Через 24 часа после пересева культура в опытных лунках подвергалась однократному воздействию электромагнитного излучения (ЭМИ) крайне высокочастотного (КВЧ) диапазона с шумовым спектром средней достаточно равномерно распределенных в диапазоне частот 53-78ГГц, мощностью 5х10-18Вт/ см2Гц. В качестве источника излучения использовали аппарат «Амфит-0,2/10-01» (Научно-исследовательский физико-технический институт, г.Нижний Новгород). Эксперименты проводили в сухом помещении при температуре 20-22ºС. Экспозиция облучения во всех опытах составляла 20 минут. Контрольные лунки оставляли без воздействия.
Состояние культуры в процессе роста контролировали с помощью инвертированного микроскопа и компьютерной программы слежения за ростом культуры. Изменение состояния культуры в процессе роста фиксировали каждые 24 часа в течение 5 суток и в те же сроки забирали пробы культуральной среды. Пробы культуральной среды из каждой лунки разливали в микропробирки и замораживали при -40ºС для последующих исследований. В опытных и контрольных пробах определяли содержание фибронектина, ИЛ-6 и ФНО-a с помощью твердофазного иммуноферментного анализа, используя наборы реагентов Bender MedSysyems (Австрия) с помощью фотометра «Sunrise» (Австрия). Анализ результатов проводился на персональном компьютере по программе Stadia.6.0
Визуальное наблюдение не позволило выявить отчетливых различий культур различного генеза. Все культуры формировали монослой приблизительно в равные сроки. Картина монослоя была характерной для культуры фибробластов с образованием типичного рисунка. Клетки были представлены преимущественно клетками веретеновидной формы с четкими контурами, выраженными отростками, плотными ядрами.
Для характеристики функциональной активности дермальных фибробластов определяли синтез одного из основных белков межклеточного матрикса – фибронектина и медиаторов воспаления – ИЛ-6 и ФНО-ά. Фиксировали изменение уровня фибронектина и цитокинов под воздействием ЭМИ-КВЧ.
Характер синтеза фибронектина у клеток неизмененной кожи различного происхождения оказался различен. У штаммов фибробластов, полученных из рубцово-измененной кожи, уровень фибронектина через 24 часа после пересева был достоверно ниже, чем у фибробластов здоровой кожи, в последующие дни он интенсивно нарастал и к четвертым суткам отчетливо превышал таковой в клетках культур неизменнной кожи. В культурах клеток кожи псориатических очагов синтез фибронектина был значительно ниже, чем в культурах клеток, полученных из биоптатов неизмененной кожи, и несколько ниже, чем в культурах клеток рубцово-измененной кожи. Процесс накопления этого белка в культурах штаммов псориатических очагов в течение первых четырех суток после пересева, хотя и проходил интенсивнее, но не достигал уровня, зафиксированного в культурах клеток неизмененной кожи. Определяли уровень спонтанного и стимулированного ИЛ-6 и ФНО- в культуральной среде дермальных фибробластов различного происхождения и накопление этих полипептидов в процессе роста культуры. В качестве стимуляторов использовали липополисахарид E.coli и фитогемагглютинин.
Характер накопления ИЛ-6 фибробластами, выделенными из здоровой кожи, значительно отличался от такового у клеток, выделенных из рубцово-измененной кожи. Отчетливые различия выявлены и в уровнях спонтанного и стимулированного образования этого полипептида клетками различного происхождения. Достоверных отличий изменения уровня ФНО- в процессе роста культур не выявлено.
После воздействия ЭМИ КВЧ у культур неизменной кожи и через 24, и через 48 часов уровень фибронектина не отличались от контроля, в то время как в культурах рубцовоизменнной кожи отмечалась отчетливая тенденция к нарастанию синтеза фибронектина (приблизительно на 15%). Одновременно отмечалось нарастание продукции ИЛ-6 по сравнению с контролем, как через 24 часа, так и через 48 часов после воздействия. При этом в культурах неизмененной кожи нарастание синтеза ИЛ-6 было достоверно интенсивнее, чем в культурах рубцовоизмененной кожи.
Таким образом, при отсутствии отчетливых объективных отличий при микроскопии культур фибробластов, полученных из разных источников, функционально эти клетки отличаются друг от друга и по-разному отвечают на воздействие ЭМИ КВЧ. Полученные результаты требуют дальнейшего исследования с возможным расширением спектра факторов, характеризующих функциональное состояния фибробластов в культуре. Изучение синтеза различных полипептидов, цитокинов, факторов роста на этапах роста культуры и изменения их под воздействием ЭМИ КВЧ представляет интерес для последующих исследований и понимания процессов, проходящих в зоне патологических очагов.