Санкт-Петербургский Государственный Университет

Эта работа опубликована в сборнике научных трудов «Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии» (2004 год, выпуск 1), под редакцией проф., д.м.н. Ильинских Н.Н. Посмотреть титульный лист сборника

1.    ВВЕДЕНИЕ
В последнее время все большее значение приобретает изучение защитных реакций организмов и их регуляции, в частности механизмов врожденного иммунитета. Особый интерес представляет изучение относительно простых защитных систем беспозвоночных животных. Это обусловлено тем, что многие процессы, из которых слагается сложнейший иммунный ответ у позвоночных животных (распознавание своего и не своего, фагоцитоз, синтез гуморальных факторов), характерны и для беспозвоночных и нередко представлены у этих животных в более простой и доступной для анализа форме.
У беспозвоночных и древнейших позвоночных животных (круглоротых) защиту от инфекций и паразитарных инвазий обеспечивает совокупность факторов врожденного иммунитета. Общими свойствами большинства этих факторов являются конститутивность их продукции (хотя индукция некоторых веществ тоже может осуществляться), широкая перекрестная реактивность и низкая специфичность распознающих рецепторов. Активация механизмов врожденного иммунитета происходит в течение короткого периода времени и обеспечивает защиту на первых этапах заражения патогенами. Именно с помощью врожденного иммунитета осуществляется контроль над уровнем естественной микрофлоры организма [1].
В течение последних 20 лет стало ясно, что традиционное представление об эффекторных молекулах врожденного иммунитета является неполным без учета роли катионных антимикробных пептидов (АМП). Открытие этих веществ вызвало очень большой интерес исследователей во всем мире, и накопленные к настоящему моменту сведения позволяют сделать вывод о том, что антибиотические пептиды являются ведущими молекулярными компонентами системы врожденного иммунитета [2]. Антимикробные пептиды являются древнейшими факторами защиты всех видов живых организмов, что свидетельствует об эффективности их функционирования. АМП дестабилизируют и в конечном итоге разрушают клеточную мембрану, вызывая серьезные системные повреждения, несовместимые с жизнедеятельностью клетки. Необходимо отметить, что in vivo АМП действуют кооперативно друг с другом и другими факторами системы врожденного иммунитета, обеспечивая наиболее эффективную защитную реакцию организма--хозяина.
    Показана важная роль антимикробных пептидов не только как микробоцидных агентов, но и как веществ, участвующих в тонкой регуляции многих защитных процессов и осуществлении интеграции систем врожденного и специфического иммунитета. В частности для антимикробных пептидов млекопитающих (- и - дефенсинов, кателицидинов), функциональные свойства которых достаточно подробно изучены, установлено, что они способны служить хемоаттрактантами для многих типов иммунокомпетентных клеток (Т-лимфоцитов, дендритных клеток, нейтрофилов, макрофагов, моноцитов)[6,7,9,11,12]. К сожалению, участие антимикробных пептидов беспозвоночных животных в регуляции защитного ответа организма до сих пор оставалось за рамками исследований.
Для огромного числа антимикробных пептидов, как эффекторных молекул врожденного иммунитета характерна локализция в гранулах фагоцитов. У полихет основную роль в осуществлении защитных реакций (фагоцитоз, инкапсуляция, заживление ран) играют свободные целомоциты, поэтому в поисках новых антимикробных пептидов мы обратились к исследованию целомоцитов пескожила. Выбор в качестве объекта исследований представителя класса многощетинковых червей определялся тем, что, в соответствии с современными представлениями, полихеты являются ключевой группой в эволюции трохофорных животных, давшей начало моллюскам и членистоногим.
    Антимикробные пептиды у этих животных еще не были обнаружены другими исследователями, хотя были описаны другие (высокомолекулярные) белковые антимикробные факторы [8]. Из целомоцитов пескожила нами был выделен новый катионный антимикробный пептид ареницин (молекулярная масса 2,7 кДа) с широким спектром действия на микроорганизмы, не имеющий структурных гомологов среди уже описанных пептидов [3]. Изучая его функциональные свойства мы решили проверить способен ли ареницин быть хемоаттрактантом для клеток целомической жидкости.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Объектом наших исследований служил пескожил (Arenicola marina), класс Polychaeta, тип Annelida, обитающий на литорали и сублиторали Белого моря.
2.1. Подготовка целомоцитов.
Пробы целомической жидкости брали в районе туловищных сегментов охлажденными до 4ОС стерильными шприцами. Плазму целомической жидкости отделяли центрифугированием и ресуспендировали осадок целомоцитов в фильтрованной морской воде (4ОС). Концентрация клеток определялась с помощью подсчета в камере Горяева.
2.2 Подготовка хемоаттрактантов.
Препарат ареницина, выделенного из целомоцитов с помощью препаративных биохимических методов, включающих препаративный электрофорез и ВЭЖХ, готовился в разведении от 10 до 1 мкг⁄мл в фильтрованной морской воде.
Препарат липополисахарида (ЛПС) (Sigma, St. Louis, USA from E.coli 0111:B4) также готовился в фильтрованной морской воде. Тестировались следующие разведения: 100, 50, 20, и от 10 до 1 мкг∕мл.
2.3 Изучение хемотаксиса.
играция целомоцитов оценивалась с помощью 48-луночной камеры Бойдена для микрохемотаксиса (Neuroprobe, MD). Использовались поликарбонатные мембраны (Neuroprobe), размер пор 3 мкм. В нижние лунки вносили раствор хемоаттрактанта в различной концентрации (объем лунки 25 мкл). В качестве контроля использовалась фильтрованная морская вода. Верхние содержали суспензию целомоцитов (107 клеток∕мл), объем лунки 48 мкл. Камеру инкубировали 1 час при 10-15 ОС. После инкубации мембрану снимали, клетки с верхней поверхности убирали с помощью специального резинового лезвия. Клетки прикрепившиеся к нижней поверхности фиксировали в растворе Май-Грюнвальда и окрашивали 10% раствором Гимза. Количество целомоцитов на мембране оценивалось подсчетом под микроскопом (увеличение X40), считали клетки в 10 полях зрения. Каждое разведение тестировали в трипликате, эксперименты повторяли три или более (5 в случае ЛПС ) раза.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ.
Целомоциты Arenicola marina проявили способность к миграции в направлении ареницина. Диапазону тестируемых концентраций соответствовала «классическая» колоколообразная кривая интенсивности хемотаксиса. Оптимальными для индукции хемотаксиса концентрациями ареницина оказались 4, 5 и 6 мкг∕мл (Рис.1), при данных концентрациях пептида интенсивность миграции увеличивалась почти в 5 раз по сравнению с контролем (p<0.05-0.001).
К сожалению, нам не удалось с такой же степенью достоверности описать способность целомоцитов к хемотаксису в отношении ЛПС, который мы в начале экспериментов намеревались использовать в качестве положительного контроля. Полученные данные имели большой разброс, вероятно, это связано с не совсем точной стандартизацией условий опытов (температуры, влажности, времени инкубации, состояния животных). При концентрациях ЛПС 10, 50 и 100 мкг∕мл хемотаксис отсутствовал, увеличение интенсивности миграции наблюдалось при концентрациях 3 и 4 мкг∕мл, и самая сильная миграция целомоцитов происходила при 1 мкг∕мл ЛПС, интенсивность примерно в 2.5 раза выше чем в контроле (Рис. 2). Возможно, подобная картина (отсутствие четкого максимума, не столь сильное как в случае антимикробного пептида отличие от контроля) объясняется тем, что тестируемый диапазон концентраций был выбран неправильно.
4. ОБСУЖДЕНИЕ.
    Антимикробные пептиды могут функционировать как внутри клетки, принимая участие в процессе фагоцитоза, так и в плазме целомической жидкости, действуя на взвешенных в ней микробов. Поскольку одной из важнейших составляющих защитного ответа организма является возможность увеличения числа целомоцитов в области проникновения инфекции, вероятно, некоторые из антимикробных пептидов могут являться хемоаттрактантами.
Полученные нами данные согласуются с результатами F. Niyonsaba et al., исследовавших хемотаксис нейтрофилов, обработанных TNF-, к -дефенсинам человека hBD-1 и hBD-2. Установленный этими исследователями оптимум концентраций антимикробных пептидов также находился в районе 5 мкг∕мл, что соответствует примерно микромолярной концентрации, и интенсивность хемотаксиса описывалась колоколообразной кривой. С другой стороны, M. C. Territo et al. и O. Chertov et al. сообщали о проявлении хемотаксиса к -дефенсинам человека НNP 1-3 моноцитами и Т-лимфоцитами, соответственно, причем оптимум концентраций дефенсинов находился в области 10-8-10-10 М. Возможно, такое расхождение в порядке действенных концентраций связано с разным механизмом взаимодействия между антимикробным пептидом и клеткой-мишенью в приведенных выше случаях.
Важным для представления и понимания процессов, имеющих место в очаге проникновения инфекции, является тот факт, что минимальная ингибирующая концентрация ареницина в отношении микроорганизмов лежит в диапазоне от 4 до 0.4 мкг∕мл. Можно предположить, что при активации целомоцитов, происходит их дегрануляция и выброс в плазму целомической жидкости антимикробных пептидов в количестве, достаточном для проявления ими микробоцидного действия, при этом одновременно происходит привлечение в очаг воспаления других целомоцитов.
Теоретически, ЛПС, как специфический компонент клеточной стенки грам-отрицательных бактерий должен быть сильным сигналом для клеток, участвующих в иммунном ответе.
Результаты, касающиеся проявления целомоцитами пескожила хемотаксиса к ЛПС, в какой-то мере согласуются с данными полученными другими исследователями. Хемотаксис у аннелид был изучен только у одного вида Lumbricus terrestris [10] и исследуемые аттрактанты не включали в себя ЛПС, поэтому мы сравнили наши данные с исследованием хемотаксиса целомоцитов сипункулиды Themiste petricola [5]. Целомоциты сипункулиды мигрировали в направлении 5 мкг∕мл ЛПС в 10 раз сильнее, и в направлении 0,1 и 1 мкг∕мл в 5 раз сильнее, чем в направлении контроля.
Таким образом, нами впервые для беспозвоночных животных выявлен феномен хемотаксиса у целомоцитов пескожила, индуцированного эндогенным антимикробным пептидом. На основании этого можно предположить, что антимикробные пептиды беспозвоночных также участвуют в регуляции защитных реакций, как и у высших позвоночных животных.
Настоящее сообщение мы рассматриваем как сугубо предварительное, являющееся отправной точкой для дальнейших более глубоких исследований в данной области.
Работа поддержана грантом МО Университеты России 07.01.030 (2004-2005 гг.),
Персональным грантом С.Пб конкурса 2004 г. для молодых ученых и специалистов М04-2.6К-329.

5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
1.Климович В.Б. Актуальные проблемы эволюционной иммунологии. //Журнал эвол. биохимии и физиол.-2002.-Т.38, N5.-С.442-450. 2. Кокряков В.Н.. Биология антибиотиков животного происхождения.//С.-Пб.:Наука. 1999.162 с. 4. Краснодембская А.Д., Алешина Г.М., Овчинникова Т. В., Краснодембский Е.Г., Кокряков В.Н.. Антимикробные пептиды из целомоцитов пескожила Arenicola marina.// Вестник СПбГУ 2001. Сер. 3, Вып.4 (27).5. Cabrera P.V. et al. Coelomocyte locomotion in the sipunculan Themiste petricola induced by exogenous and endogenous chemattractants: role of a CD44-like antigen-HA interaction.//Journal of Invertebrate Pathology. 2002. Vol.79. P.111-119. 6.Chaly Y. et al. Human neutrophil -defensin modulates cytokine production in human monocytes and adhesion molecule expression in endothelial cells.// Eur.Cytokine.Netw.2000. Vol.11. N2. P.257-266. 7. Chertov O. et al. Identification of defensin-1, defensin-2 and CAP37/azurocidin as T cell chemоattractant proteins released from interleukin-8-stimulated neutrophils.// J.Biol.Chem. 1996. 271:2935. 8. Cooper Edwin L., Kauschke Ellen, Gossarizza Andrea. Digging for innate immunity since Darwin and Metchnikoff.// BioEssays. 2002. Vo.l 24. P. 319-333. 9. Niyonsaba F. et al. Human -defensin-2 functions as a chemotactic agent for tumor necrosis factor--treated hyman neutrophils. //Immunology.2004. Vol. 111. P. 273-281. 10. Stein Elizabeth A. and Edwin L. Cooper. Inflammatory responses in Annelids.// Amer.Zool. 1983. Vol.23. P.145-156. 11. Territo M.C. et al. Monocyte chemotactic activity of defensins from human neutrophils.// J.Clin.Invest. 1989. 84:2017 12.Yang D. et al. Multiple roles of antimicrobial defensins, cathelicidins, and eosinophil-derived neurotoxin in host-defense.//Ann.Rev.Immunol. 2004. Vol.22. P.06.1-06.35. 9.