Самарский государственный медицинский университет

Муковисцидоз (МВ) – частое моногенное заболевание, определенное мутацией гена муковисцидозного трансмембранного регулятора, характеризующееся поражением экзокринных желез жизненно важных органов и систем и имеющее, как правило, тяжелое течение [1]. Прогноз пациентов с МВ в первую очередь зависит от тяжести поражения органов дыхания. В патогенезе данных изменений ведущая роль принадлежит Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa. У пациентов в возрасте до 9 лет из мокроты также могут выделяться Haemophilus influenzae и Streptococcus pneumoniae. Реже могут встречаться представители семейства Enterobacteriaceae [2]. У больных старших возрастных групп инфекционный процесс может быть обусловлен Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas maltophilia, грибами рода Candida и Aspergillus [3]. 
Если S.aureus часто выступает как первый микроорганизм, выделяемый из мокроты или кашлевого мазка новорожденных с МВ, не получавших длительной антистафилококковой терапии, то неферментриующие грамотрицательные бактерии (НФГОБ) выделяются у пациентов на протяжении всей жизни [4].
P.aeruginosa является наиболее часто описываемым оппуртонистическим патогеном у пациентов с МВ: она чаще других выделяется из мокроты или бронхоальвеолярного лаважа больных МВ всех возрастных групп [5, 6, 7]. У большинства пациентов с MB, вы¬деляющих мокроту и носящих мукоидный P.aeruginosa, наблюдается незамедлительное и более быстрое снижение функции легких в сравнении с больными MB без инфекции P.aeruginosa. Увеличение объемов мокроты коррелирует с нарастанием воспаления, числа нейтрофилов и свободных протеиназ серина и, следовательно, с более тяжелой обструкцией и деструкцией легочной ткани.
Если немукоидная P.aeruginosa выделяется преимущественно в культурах in vitro из орофарингеальных образцов, взятых вскоре после начала инфекции, то мукоидная P.aeruginosa, характеризующаяся формированием покрытых экзополисахаридами (альгинат) микроколоний (рост по типу биофильма), выявляется практически во всех случаях хронической инфекции. Мукоидная P.aeruginosa более устойчива к фагоцитозу и может ограничивать пенетрацию антибиотиков [8]. Мукоидная P.aeruginosa часто неподвижна – такой фенотип стойко сохраняется в богатой питательными веществами, преимущественно анаэробной среде. При росте P.aeruginosa по типу биофильма требуется в 100-1000 раз более высокие концентрации определенного антибиотика в сравнении с тестированием антибиотика при немукоидном варианте этого патогена. Тем не менее, при тестировании некоторых антибиотиков установлена более высокая резистентность немукоидных изолятов в сравнении с мукоидными [9, 10].
Как уже было сказано выше, дыхательные пути пациентов с МВ характеризуются врожденной чувствительностью к оппортунистическим внешним патогенам, в частности к представителям неферментирующих грамотрицательных бактерий. Следует отметить тот факт, что представители семейства НФГОБ характеризуются выраженной антибиотикорезистентностью, что создает огромные проблемы для терапии. При этом устойчивость может быть как природной, связанной с мутациями в хромосоме, так и приобретенной, чаще плазмидоопосредованной.
Как правило, инфицирование штаммами НФГОБ происходит в период госпитализации пациента в стационар, т.е. является по своей сути нозокомиальным. При этом в условиях стационара создаются предпосылки для селекции резистентных штаммов. Еще одной особенностью представителей НФГОБ является сложность их видовой идентификации. Несмотря на то, что существует несколько алгоритмов определения этих микроорганизмов, основанных на их биохимической активности, большинство из них не являются высокочувствительными и специфичными. Между тем, определение вида микроорганизма является залогом грамотной и эффективной антибактериальной терапии.
Важную роль в развитии легочной инфекции у многих пациентов с МВ играет Acinetobacter spp. Данный микроорганизм в силу своих структурных особенностей не способен вызвать инфекционный процесс у здоровых людей, но у пациентов с МВ он является вторым представителем НФГОБ по частоте встречаемости после P.aeruginosa. При этом Acinetobacter spp. обладает выраженной способностью к формированию антибиотикорезистентности, реализуемой за счет комплекса механизмов. Помимо продукции β-лактамаз устойчивость у штаммов Acinetobacter spp. может реализовываться за счет изменения проницаемости наружной мембраны и изменения структуры пенициллин-связывающих белков. При этом все перечисленные механизмы могут быть реализованы одновременно [11,12,13].
Несколько реже встречается В.cepacia. Комплекс B.cepacia (P.cepacia - по прежней терминологии) представляет собой группу из минимум девяти тесно связанных друг с другом бактериальных видов, которые выделяются в ка¬честве патогенов при MB в течение последних двадцати лет [14,15]. Данные многих исследований подтвержда¬ют высокий уровень передаваемости и вирулентности B.cepacia, геномовар III (теперь обозначается как B.cenocepacia) у пациентов с MB [16]. Выявление B.cepacia у пациентов с МВ расценивается рядом исследователей как прогностически неблагоприятный факт. При этом авторы указывают на резкое снижение дыхательной функции уже после первого эпизода выделения этого микроорганизма. Отдельную проблему представляет резистентность B.cepacia к некоторым группам антибактериальных препаратов в частности к карбапенемам и аминогликозидам. Эти препараты часто являются средствами выбора в терапии инфекций дыхательных путей при МВ. Следует учитывать природную резистентность к данным антибиотикам при назначении терапии.
S.maltophilia (раньше обозначалась как P.maltophilia, затем как X.maltophilia) вы¬деляется в мокроте пациентов с MB приблизительно с той же частотой, что и B.cepacia. Однако опубликованные на сегодня исследования не позволяют вы¬нести окончательного заключения о том, связано ли выявление этой инфекции с повышением уровней болезненности и смертности [17, 18, 19]. Особую проблему составляет терапия инфекции, ассоциированной со S.maltophilia. Дело в том, что данный микроорганизм обладает выраженной природной резистентностью ко многим классам антимикробных препаратов, за счет наличия у нее β-лактамаз L -1 и L -2.
Таким образом, группа НФГОБ представляет серьезную проблему для терапии бронхолегочной инфекции при МВ.
Материал и методы исследования. Было проведено микробиологическое обследование 37 проб мокроты, полученных от 34 пациентов с МВ. Сбор мокроты проводился рано утром, сразу после пробуждения пациента. Непосредственно перед сбором пациент чистил и тщательно полоскал полость рта. После этого больному предлагалось глубоко прокашляться. Образцы мокроты собирались в стерильные пластиковые контейнеры и доставлялись в лабораторию не позднее 2 часов после сбора. В лаборатории взятый от больного материал засевался на питательные среды: кровяной агар, мясопептонный агар, агар Мюллер-Хинтона для определения чувствительности к антибиотикам. Посевы инкубировали в термостате при температуре 370С в течение 24-48 часов.
При оценке выросших колоний микроорганизмов учитывались соответствующие культуральные свойства. После накопления чистых культур, проводили идентификацию выделенных микроорганизмов. Для идентификации неферментирующих грамотрицательных бактерий применялся набор «системы индикаторные бумажные для идентификации микроорганизмов №7» (Россия).
Полученные результаты и их обсуждение. В результате микробиологического исследования мокроты был выделен 81 штамм микроорганизмов. У всех 34 обследованных пациентов с МВ (100%) выделялись микроорганизмы из НДП. При этом среди выделенных микроорганизмов 28 штаммов (34,6±5,3%) были клинически незначимыми и явились следствием контаминации мокроты жидкостью ротовой полости. Клинически значимые микроорганизмы выделялись у 32 пациентов (94,1±4,0%).
В структуре клинически значимой выделенной микрофлоры доминирующее положение занимали неферментирующие грамотрицательные микроорганизмы (НФГОБ), среди которых лидирующее место принадлежало P.aeruginosa.
  Структура и количественная характеристика клинически значимых микроорганизмов, выделенных из НДП пациентов с МВ представлена в таблице 1.

 

Таблица 1. Структура НФГОБ, выделенных из НДП пациентов с МВ.

Микроорганизм	Пациенты с МВ
	Количество штаммов (n=27)	M±m
P.aeruginosa немукоидная форма	10	18,9±5,4%
P.aeruginosa мукоидная форма	4	7,5±3,6%
Acinetobacter spp.	4	7,5±3,6%
B.cepacia	2	3,7±2,6%
S.maltophilia	3	5,6±3,2%
P.diminuta	2	3,7±2,6%
P.alcaligenes	2	3,7±2,6%

При обследовании пациентов с МВ в подавляющем большинстве случаев, в 20 образцах (58,8±8,4%), выделялись монокультуры, и только в 14 образцах (41,2±8,4%) - ассоциации микроорганизмов. 
Наиболее распространенными сочетаниями у пациентов с МВ были S.aureus, грибы рода Candida, S.aureus и НФГОБ, комбинации всех трех указанных микроорганизмов и, кроме того, встречались сочетания НФГОБ с представителями рода Streptococcus. В 1 (2,9±2,8%) случае нами была выделена ассоциация мукоидного и немукоидного штаммов P.aeruginosa со штаммом S.maltophilia. Обнаружение подобных сочетаний микроорганизмов расценивается как крайне неблагоприятное для больного.
В 9 (26,4±7,5%) случаях отмечалось наличие 2 штаммов в мокроте пациентов с МВ, в 5 (14,7±6,0%) случаях – 3 штаммов микроорганизмов.
Среди монокультур, выделенных у пациентов с МВ, большинство составляли НФГОБ. Из них в 8 (40,0±10,9%) случаях была выявлена P.aeruginosa (в двух случая в мукоидной форме), в 2 (10,0±6,7%) случаях - Acinetobacter spp. и у одного ребенка -S.maltophilia (5,0±4,9%). Было выделено 27 штаммов НФГОБ от 20 пациентов с МВ из 34 обследованных. При этом у 8 (40,0±10,9%) пациентов это было первое в жизни выявление НФГОБ. Из них у 7 (87,5±11,7%) было первое выделение P.aeruginosa и у одного больного (12,5±11,7%) - B.cepacia. Особый интерес, по нашему мнению, представляет тот факт, что более чем у трети пациентов за период обследования отмечался дебют синегнойной инфекции.
В структуре выделенных штаммов значимое место занимала P.aeruginosa (14 штаммов, 51,9±9,6%). При этом 10 штаммов (71,4±12,0%) были в немукоидной и 4 (28,6±12,0%) в мукоидной форме. В 8 случаях P.aeruginosa выделялась в монокультуре (при этом в 2 случаях в мукоидной форме), в остальных случаях в ассоциации с другими микроорганизмами.
Как известно, выделение мукоидных штаммов синегнойной палочки является прогностически неблагоприятным фактором для больного. Мукоидные штаммы были выделены от 2 пациентов (5,8±4,0%), у 2 пациентов мукоидный штамм был выделен в монокультуре.
На втором месте по частоте выделения среди всех НФГОБ были представители рода Acinetobacter (4 штамма, 14,8±6,8%), при этом в 2 случаях (50,0±9,6%) Acinetobacter spp. выделялся в виде монокультуры. На третьем месте по частоте встречаемости была S.maltophilia (3 штамма, 11,1±6,0%). В 2 случаях возбудитель выделялся в комбинации с другими микроорганизмами, из них у 1 ребенка (33,3±9,1%) в комбинации с S.aureus и в 1 случае (33,3±9,1%) в комбинации с 2 штаммами P.aeruginosa. В 1 (33,3±9,1%) случае микроорганизм был выделен в монокультуре. В равной степени часто встречались B.cepacia, P.alcaligenes и P.diminuta по 2 штамма (7,4±5,0%), соответственно.
Штаммы B.cepacia выделялись в обоих случаях в комбинации с S.pneumoniae, при этом в одном случае третьим патогеном были грибы рода Candida. Штаммы P.alcaligenes и P.diminuta выделялись в виде 2 штаммов одного вида у одного больного, и 2 штаммов одного вида у другого, больного соответственно. При этом штаммы одного вида имели различные профили резистентности и различия в культуральных свойствах.
Штаммы P.aeruginosa и Acinetobacter spp. выделялись преимущественно у пациентов со смешанной формой и тяжелым течением заболевания. Штаммы S.maltophilia, B.cepacia, P.alcaligenes и P.diminuta встречались преимущественно у пациентов со среднетяжелым вариантом течения МВ. У пациентов с легким течением заболевания не было случаев выделения НФГОБ.
Заключение. В результате проведенного микробиологического исследования были выявлены особенности распространенности НФГОБ среди пациентов с МВ. С учетом прямой зависимости тяжести течения заболевания и выделения НФГОБ из НДП, а также преобладание выделения данной группы микроорганизмов в монокультуре можно сделать вывод о значительной роли этой группы бактерий в развитии патологического процесса у пациентов с МВ. При этом необходимо отметить возрастающую роль ранее не определявшихся представителей НФГОБ, помимо P.aeruginosa, видовые особенности антибиотикорезистентности которых могут значительно усложнять терапию пациентов. По этой причине необходима разработка современных и доступных методов выделения и видовой идентификации НФГОБ.
Список литературы.
[1] Иващенко, Т.Э. Биохимическое и молекулярно-генетичские аспекты патогенеза муковисцидоза [Текст]/ Т. Э. Иващенко, В.С. Баранов.- СПб: «Интермедика», 2002.- 256с.
[2] Riordan J.R. Identification of the cystic fibrosis gene: Cloning and characterizatoin of complementary [Text]/ J.R. Riordan, J.M.Rommens, B.S.Kerem at al.//Science.-1989.-Vol. 245.-P.1066-1073.
[3] Капранов, Н.Н. Муковисцидоз – современное состояние проблемы/ H.Н. Капранов//Пульмонология. Приложение по муковисцидозу.-2006.-С.5-11.
[4] Cystic Fibrosis Foundation Patient Registry 2001 Annual Data Report, Bethesda, MD,USA. Cystic Fibrosis Foundation 2002.
[5] Anonymous. Cystic fibrosis foundation patient registry 1997 annual data report. Bethesda, MD, USA. Cystic Fibrosis Foundation 1998.
[6] Botzenhart, K., Epidemiology and ecology of Pseudomonas aeruginosa. In M. Campa, M. Bendinelli, H. Friedman, eds. Pseudomonas aeruginosa as an oppurtonistic pathogen [Text]/K. Botzenhart, G. Doring// New York, Plenum Press.-1993.-1-18.
[7] Hoiby, N. Microbiology of lung infections in cystic fibrosis patients [Text]/N. Hoiby//Acta Paediatr Scand Suppl.-1982.-301.-33-54.
[8] Cabral, D.A. Mucoid Pseudomonas aeruginosa resists nonopsonic phagocytosis by human neutrophillus and macrophages. [Text]/D.A. Cabral, B.A. Loh, D.P. Speert// Pediatr Res.-1987.-22.-429-431.
[9] Ceri, H. The Calgery Biofilm Device: new technology forrapid determination of antibiotic suspectibilities of bacterial biofilm [Text]/ H. Ceri, M.E. Olson, C. Stremick, R.R. Read, D. Morck, A Buret//J Clin Microbiol 1999.-37.-1771-1776.
[10] Shwar, P.M. Activities of tobramycin and six other antibiotics against Pseudomonas aeruginosa isolates from patients with cystic fibrosis [Text]/P.M. Shwar, D.L. MacLeod, R.L.Garber et al.//Antimicrob Agents Chemother.-1999.-43.-2877-2880.
[11] Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии. / Под ред. Л.С. Страчунского, Ю.Б. Белоусова, С.Н. Козлова. – М.:МАКМАХ, 2002. – 382 с.
[12] Практическое руководство по антимикробной химиотерапии/ Под ред. Л.С. Страчунского, Ю.Б. Белоусова, С.Н. Козлова. – Смоленск: МАКМАХ, 2007.-464с.
[13] Страчунский, Л.С. Клиническая фармакология антибиотиков / Л.С. Страчунский, С.Н. Козлов, А.В. Дехнич. – Смоленск: СГМА.-2004.-128с.
[14] Coenye, T. Taxonomy and identification of the Burkholderia cepacia complex [Text]/ T. Coenye, P. Vandamme, J.R.W. Govan, J.J. LiPuma// J Clin Microbiol.-2001.-39.-3427-36.
[15] Vandamme, P. Burkholderia anthina sp. nov. and Burkholderia pyrrocinia, two additional Burkholderia cepacia complex bacteria, may confound results of new molecular diagnostic tools [Text]/P. Vandamme, D. Henry, T. Coenye, S. Nzula, M. Vancanneut, J.J. LiPuma, D.P. Speert, J.E.W. Govan, E. Mahenthiralingam//FEMS Immunol Med Microbiol.-2002.-33.-143-9.
[16] Vandamme, P. Burkholderia cenocepacia sp. nov. – a new twist to an old story [Text]/ P.Vandamme, B. Holmes, T. Conye, J. Goris, E. Mahenthiralingam, J.J. LiPuma, J.R.W. Govan//Res Microbiol.-2003.-154.-91-6.
[17] Cystic Fibrosis Foundation Patient Registry 2001 Annual Data Report, Bethesda, MD,USA. Cystic Fibrosis Foundation 2002.
[18] Demko, C.A. Stenotrophomonas maltophilia in cystic fibrosis: incidence and prevalence [Text]/C.A. Demko, R.C. Stern, C.F. Doershuk// Pediatr Pulmonol.-1998.-25.-304-8.
[19] Denton, M. Microbiological and clinical aspects of infection associated with Stenotrophomonas maltophilia [Text]/ M. Denton, K.G. Kerr// Clin Microbiol Rev.-1998.-11.-57-80.