Эта работа опубликована в сборнике статей по материалам Международной 65-й научной студенческой конференции им. Н.И. Пирогова (г.Томск, 2006 год) под редакцией проф. Новицкого В.В. и д.м.н. Огородовой Л.М.

Посмотреть титульный лист сборника

Скачать сборник целиком (1,5 мб)

На протяжении последних трех десятилетий иммуноферментные методы анализа (ИФА) интенсивно развивались как в теоретическом, так и практическом плане, и к настоящему времени они сформировались в самостоятельное научное направление, имеющее важное прикладное значение [1].

Особый интерес представляет применение ИФА для диагностики таких эндемичных для Западной Сибири инфекций, как клещевой энцефалит и иксодовый клещевой боррелиоз [2].  Получение образцов положительных контрольных сывороток от доноров, для диагностики иксодовых клещевых боррелиозов сопряжено с рядом трудностей:

·                     спектр специфических антител у инфицированных пациентов может варьировать в связи с разнообразием антигенов спирохеты;

·                     максимальный титр иммуноглобулинов класса G (IgG) обнаруживается только через  1,5-3 месяца после инфицирования и приходится на вторую стадию развития заболевания;

·                     низкие титры антител к боррелиям в сыворотке крови пациентов с подтвержденным диагнозом болезни Лайма не позволяют получать контрольные образцы для диагностики.

Целью данной работы являлась разработка технологии получения положительных контрольных сывороток от животных (кроликов) и их дальнейшая хьюманизация путем сайт-направленной конъюгации с нативными молекулами IgG человека.

Материал и методы. Работа была выполнена на базе отделения медико-биологических проблем филиала ФГУП НПО «Микроген» МЗ РФ  г. Томск, НПО «Вирион». В работе использовался препарат «Иммуноглобулин человеческий нормальный» и сыворотка крови кролика, фракция IgG, из которой была выделена преципитацией полиэтиленгликолем с молекулярной массой 6000 (ПЭГ-6000) и последующей хроматографией на DEAE-Toyopearl 650 M с использованием системы ступенчатого элюирования 0,02 М натрий-фосфатным буфером с рН 7,2. Молекулярные параметры полученного препарата IgG кролика были проконтролированы гель-фильтрацией на Toyopearl HW–55 F, фракция мономеров и димеров составила около 90,6 %. Перед конъюгацией проводили концентрирование раствора кроличьего IgG для получения 10 мг/мл (по белку) на центрифужных концентраторах Amicon-15 (порог исключения мембраны 10 кДа).

Препарат IgG человека разводили до концентрации 10 мг/мл 0,001 М натрий-ацетатным буфером с рН 5,0 и окисляли раствором перйодата натрия (NaJO₄). Окисленные антитела отделяли от избытка NaJO₄ гель-фильтрацией на Sephadex G-25 и доводили концентрацию до 10 мг/мл, также как описано выше. Затем для получения гидразид-активированных производных иммуноглобулинов к ним добавляли адипоилдигидразид, который соединялся с молекулой-мишенью в ходе инкубации при комнатной температуре. Для стабилизации образовавшихся связей в качестве восстанавливающего агента к смеси добавляли раствор боргидрида натрия (NaBH₄). Модифицированные антитела очищали от избытка реагентов гель-фильтрацией на Sephadex G-25 и концентрацию доводили до 10 мг/мл, как было описано ранее. Непосредственно перед конъюгацией антитела человека переводили в натрий-фосфатный буфер с рН 7,2 путем диализа. Смешивали раствор IgG кролика, которые были предварительно перйодатно-окисленных (по приведенной выше методике) с раствором гидразид-активированных производных иммуноглобулинов человека. Полученную смесь инкубировали при комнатной температуре, восстановление и стабилизацию связей проводили с помощью раствора NaBH₄. Удаление избытка реагентов и отделение фракции мономеров IgG от полученных гибридных антител проводили путем гель-фильтрации на Sephacryl S-200 HR.

Для сохранения биологических свойств иммуноглобулинов кролика необходимо было использовать метод, позволяющий проводить конъюгацию, не затрагивая                             антиген-распознающие центры молекулы. Сутью примененного метода является образование дигидразидного мостика между локализованными в молекуле углеводными остатками, которые были предварительно окислены NaJO₄ для получения альдегидных групп [3]. Данная схема конъюгирования молекул обеспечивает сайт-направленное образование гибридных антител, что особенно важно для стандартизации полученного препарата. 

Полученная в ходе экспериментов фракция, содержащая гибридные IgG была проанализирована путем электрофореза в 7,5 % полиакриламидном геле (ПААГ) по методу Лэмли и гель-фильтрации на Sephacryl S-200 HR, концентрация белка в препарате была определена по методу Брэдфорд. Специфическая активность гибридных иммуноглобулинов сравнивалась с контролем (IgG фракцией сыворотки крови кролика  с концентрацией белка 10 мг/мл) методом двойной радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони. В качестве антигена, использовавшегося для иммунизации и тестирования, был использован комплекс растворимых антигенов В. burgdorferi, полученный сонификацией бактерий в присутствии детергентов. Результаты тестов, перечисленных выше, приведены в таблице.

Таблица

Характеристика гибридных молекул иммуноглобулинов

Опираясь на результаты электрофореза и гель-фильтрации можно сделать вывод о том, что данный метод позволяет получать гибридные антитела, молекулярная масса которых сходна с димерами IgG. Двукратное снижение титров антител по сравнению с контролем может быть объяснено образованием димеров иммуноглобулинов класса G человека, которые не способны связываться с комплексом растворимых антигенов B. burgdorferi. Таким образом, разработанная технология получения гибридного комплекса иммуноглобулинов может быть использована для получения положительных контрольных образцов для иммуноферментного анализа.

Список литературы:

1.         Егоров, А. М. Теория и практика иммуноферментного анализа / А. М. Егоров, А. П. Осипов, Б. Б. Дзантиев, Е. М. Гаврилова. − М. : Высшая школа, 1991. – 288 с.

2.         Офицеров, В. И. Лайм боррелиоз и его диагностика / В. И. Офицеров // Новости «Вектор-Бест». – 2003. – Т. 28, № 2. – С. 6−9.

3.         Hermanson, G. T. Bioconjugate Techniques / Greg T. Hermanson. – San Diego, California : Academic Press, 1996. – 785 c.