Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск
Кафедра фундаментальных основ клинической медицины
Эта работа опубликована в сборнике статей по материалам Международной 68-й научной итоговой студенческой конференции им. Н.И. Пирогова (г.Томск, 20-22 апреля, 2009 год); под реакцией академика РАМН В.В. Новицкого, член. корр. РАМН Л.М. Огородовой
Посмотреть титульный лист сборника
Скачать сборник целиком (1,5 мб)
Известно, что интерлейкин-4 (ИЛ-4) является одним из участников формирования иммунопатологических состояний. В результате взаимодействия ИЛ-4 со своим рецептором, представленным на поверхности клетки, запускается каскад ферментативных процессов, приводящий к транскрипции генов и наработке новых белков, что в итоге может привести как к активации пролиферации клеток, так и к их гибели [1]. Предполагают, что в регуляции апоптоза ИЛ-4 вовлечены рецепторный, митохондриальный и р53-опосредованный пути [2]. Однако имеющиеся данные о молекулярных механизмах участия ИЛ-4 в апоптозе недостаточно изучены.
Целью работы явилось исследование молекулярных механизмов регуляции апоптотической гибели лимфоцитов крови ИЛ-4.
Для исследования использовались лимфоциты крови, полученные у 12 здоровых доноров. Кровь брали утром натощак из локтевой вены. Лимфоциты выделяли стандартным методом на градиенте плотности Ficoll-Paque. Культивирование проводили в питательной среде RPMI-1640 («Вектор-Бест», Новосибирск) с добавлением разных концентраций рекомбинантной формы ИЛ-4 (рИЛ-4) (от 0,015 до 1,000 нг/мл). Регистрация апоптоза осуществлялась методом проточной цитометрии с использованием FITC-меченного аннексина V и пропидия йодида («Beckman Coulter», США). Оценку уровня фактора транскрипции р53 и белков семейства Bcl-2 проводили с помощью вестерн-блоттинга. Полученные результаты обрабатывали статистическими методами. Проверку на нормальность распределения количественных показателей осуществляли по критерию Колмогорова-Смирнова. Достоверность различий между независимыми группами устанавливали с помощью непараметрического двустороннего U-критерия Манна-Уитни и критерия Краскела-Уоллиса.
Изучая дозозависимое влияние рИЛ-4 на апоптоз, было выявлено, что процент апоптотических клеток в культуре лимфоцитов не менялся при концентрациях цитокина 0,015, 0,025, 0,050, 0,100 нг/мл. Достоверный подъем данного параметра наблюдался при дозе цитокина от 0,10 до 0,25 нг/мл. Наибольший процент апоптотических клеток обнаруживался при культивировании лимфоцитов с рИЛ-4 в дозе 0,50 нг/мл. Статистически значимое увеличение процента апоптотически трансформированных лимфоцитов отмечалось в результате действия на них рИЛ-4 в дозе 0,50 нг/мл по сравнению с интактными клетками. Мы предположили, что данная концентрация может являться проапоптотической и достаточной для запуска программированной клеточной гибели.
При добавлении проапоптотической дозы рИЛ-4 в лимфоцитах снижалось содержание антиапоптотических белков Bcl-2 и Bcl-xL в 3 и 1,6 раза соответственно по сравнению с интактными клетками. Данное снижение, вероятно, происходит в следствии инактивации генов белков Bcl-2 и Bcl-xL. Регуляция активности генов про- и антиапоптотических белков осуществляется с помощью транскрипционного фактора р53, уровень которого также исследовался в ходе работы. Нами было отмечено достоверное уменьшение внутриклеточного содержания белка р53 при культивировании лимфоцитов с проапоптотической дозой рИЛ-4 по сравнению с интактными клетками. Вероятно, в результате фосфорилирования белок р53 стимулировал снижение своей активности и ускорение своего распада, что мы и зарегистрировали в эксперименте. [3]
Таким образом, проведенное исследование показало, что имеет место дозозависимое действие ИЛ-4 на апоптоз лимфоцитов крови, запуск которого может происходить как через активацию транскрипционного фактора р53, так и через митохондриальный путь, в результате изменения баланса между про- и антиапоптотическими белками. Возможно, эти процессы взаимосвязаны и следуют друг за другом. Однако нельзя исключать вовлечение в сигнальную трансдукцию других молекул, приводящих к индукции митохондриального механизма программированной клеточной гибели.
Список литературы:
1. Хаитов Р. М. Физиология иммунной системы. – М. : ВИНИТИ РАН, 2001. – 224с.
2. Human Protein Reference Database / T. S. Prasad, R. Goel, K. Kandasamy et al. // Nucleic Acids Res. - 2009. – P. 767 – 772.
3. Мушкамбаров Н. Н, Кузнецов С. Л. Молекулярная биология. – М., МИА, 2003. – С.468.
