|
Научный руководитель: д-р мед. наук, проф. В. В. Климов
Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск
Введение. Атопический дерматит (АтД) является одной из наиболее распространенных форм аллергического поражения кожи. Показатель распространенности АтД растет во всем мире. Распространенность АтД в детской популяции составляет до 15-30%, во взрослой - до 2-10% [1]. Иммунопатогенез АтД - многоэтапный и сложный процесс, полностью не изученный до настоящего времени и требующий дальнейшего более подробного исследования.
АтД - хроническое воспалительное заболевание кожи, развивающееся по IgE-зависимому механизму, патогенез которого связан с дисбалансом иммунорегуляторных субпопуляций в сторону поляризации Тх2 и соответствующим изменением их цитокинового профиля.
Исследование цитокинового профиля при АтД позволяет оценить характер воспаления, а также назначить соответствующую противовоспалительную терапию.
Цель работы. Определить концентрацию IL-4, IL-10, IL-17 и IFN-y в бесклеточной фракции экссудата «кожного окна» при атопическом дерматите в разные стадии болезни и в разных участках кожи.
Материал и методы. Концентрация цитокинов определялась в бесклеточных кожных экссудатах, получаемых согласно патенту № 1534395 на изобретение «Способ диагностики аллергического диатеза» В.В. Климова, Т.В. Кошовкиной, В.К. Раткина и А.А. Денисова (1993) и медицинской технологии «Способ оценки минимальной воспалительной активности кожи при атопическом дерматите в стадии ремиссии» ФС №2010/217 (2010) [2, 3]. Обследовано 59 больных АтД и 10 здоровых добровольцев. Диагноз АтД устанавливался на основании данных анамнеза, клинической картины, кожного аллергологическо-го тестирования, содержания IgE. Степень тяжести заболевания устанавливалась с учетом индекса SCORAD.
Переднюю сторону предплечья дезинфицировали спиртом. Затем в средней трети ладонной поверхности предплечья с помощью стерильного скальпеля удаляли верхний слой эпидермиса, не затрагивая более глубокие слои кожи. Удалив роговой слой на участке кожи площадью 0,5x0,5 см образовывалась поверхность с характерным блеском. Слой шиповатых клеток, базальных клеток и базальная мембрана эпидермиса оставались интактными. На скарифицированный участок помещали камеру объемом 1,0 мл, предварительно заполненную с помощью шприца стерильной средой 199. Камеру фиксировали на коже с помощью лейкопластыря. Круговая обвязка предплечья лейкопластырем обеспечивала наиболее надежную фиксацию камеры.
Через 6 часов камера снималась, ее содержимое пипеткой собиралось и переносилось в пробирку. После центрифугирования экссудата получался супернатант, который в дальнейшем использовался для определения цитокинов.
С этой целью использовался твердофазный ИФА с применением пероксидазы хрена в качестве индикаторного фермента. Основным реагентом набора являются моноклональные антитела к определяемому цитокину, иммобилизованные на поверхности лунок полистирольного планшета. Другой тип моноклональных антител к независимому эпитопу молекулы цитокина находится в наборе в виде конъюгата с биотином. Индикаторным компонентом является конъюгат стрептавидина с перок-сидазой хрена. После нескольких стадий инкубации и отмывок, количество связавшегося конъюгата с пероксидазой хрена, определяют цветной реакцией с использованием субстрата для пероксидазы хрена - перекиси водорода. Интенсивность окрашивания прямо пропорциональна концентрации определяемого цитокина. Активность связанной перокси-дазы измеряют с использованием автоматического фотометра для микропланшетов.
Для определения продукции IL-4, IL-10, IL-17 и IFN-y были использованы наборы реагентов «ИЛ-4-ИФА-БЕСТ», «ИЛ-10-ИФА-БЕСТ», «ИЛ-17-ИФА-БЕСТ» и «гамма-ИНТЕРФЕРОН-ИФА-БЕСТ» (ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск). Постановку ИФА проводили в соответствии с методическими рекомендациями производителя.
Анализ результатов ИФА проводили на микропланшетном ридере Multiscan EX («Labsystems», Финляндия). Расчет концентрации цитоки-нов осуществлялся по калибровочной кривой с помощью компьютерной программы. Количество выражали в пикограммах на миллилитр (пг/мл). Статистическая обработка результатов исследования проводилась с помощью пакета статистических программ «SPSS». Для представления количественных данных, не подчиняющихся нормальному закону распределения, использовались описательные статистики: Ме (медиана), Q1 (1-й квартиль (25%)) и Q3 (3-й квартиль (75%)). Для всех имеющихся выборок данных применялись непараметрические критерии Крас-кал-Уолиса и Манна - Уитни.
Также была исследована зависимость концентраций цитокинов от конкретных участков кожи (условно здорового или лихенифицированно-го), на которые устанавливась камеры. Сделан анализ, где учитывались данные по содержанию цитокинов кожного экссудата в разных местах установки камеры.
Результаты и обсуждение. В периоде ремиссии сохраняется, в основном, та же направленность в отклонениях в содержании цитокинов, что была отмечена в периоде обострения. Наблюдаются высокие уровни IL-4 и IL-10, при этом снижение IFN-y в стадию ремиссии более значительное и достоверно отличается по отношению к обобщённой группе больных АтД в остром периоде. Эти данные согласовываются с литературным источником [1].
Далее для исследования зависимости концентраций цитокинов от конкретных участков кожи (условно здорового или лихенифицированно-го), на которые устанавливась камеры, сделан анализ, где учитывались данные по содержанию цитокинов кожного экссудата в разных местах установки камеры.
В результате исследования было установлено, что место установки камеры влияет только на IL-10, содержание которого существенно возрастает в очагах лихенификации по сравнению со здоровыми участками кожи. Это согласовывается с особенной ролью IL-10 в аллергических процессах. IL-10 вырабатыввается несколькими видами клеток (Тх2, Tr1, дендритные клетки и др.). По-видимому, многие их них вовлечены в процессы ремоделлирования кожи. Выводы:
1. В периодах обострения и ремиссии АтД отмечается повышение IL-4 и снижение IFN-y. При этом снижение IFN-y в стадию ремиссии более значительное и достоверно отличается по отношению к обобщённой группе больных АтД в остром периоде.
2. Место установки камеры влияет только на IL-10, содержание которого существенно возрастает в очагах лихенификации по сравнению со здоровыми участками кожи.
Список литературы:
1. Atopic Dermatitis / Bernice R Krafchik // eMedicine, Jan 19, 2010 [Электронный ресурс] - Режим доступа: http://emedicine.medscape.com/article/1049085-overview
2. Медицинская технология «Способ оценки минимальной воспалительной активности кожи при атопическом дерматите в стадии ремиссии" ФС№2010/217 от 10.06.2010// Климов В.В., Денисов А.А., Фирсова Е.К, Саликова Т.И., Загрешенко Д.С.
3. Пат. 1534395 РФ. Способ диагностики аллергического диатеза / Климов В.В., Кошовкина Т.В., Раткин В.К. и др.; опубл. 10.09.1993.
4. Ключевые цитокины профиля Th1 и Th2 в кожном экссудате при атопическом дерматите / Д. С. Загрешенко // "Науки о человеке" // Сибирский государственный медицинский университет - Томск, 2007. - 273 с.
|
