ЗАО «Вектор-Бест», п. Кольцово, НСО

Эта работа опубликована в сборнике "НАУКИ О ЧЕЛОВЕКЕ" – Сборник статей молодых ученых и специалистов /Под ред. Л.М. Огородова, Л.В. Капилевич. – Томск, СГМУ.- 2002.-254 с.

Скачать сборник целиком

Гепатит В — глобально распространенная вирусная инфекция. Ежегодно в мире регистрируется около 50 млн. больных только с острой формой вирусного гепатита В (ВГВ). Сложность клинической диагностики, часто бессиптомное протекание начальных стадий заболевания и высокий процент хронизации требуют развития быстрых и надежных лабораторных методов мониторинга развития и течения вирусных гепатитов, контроля их терапии. Данная работа посвящена разработке тест-системы на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-ферментной детекцией результатов для количественной оценки концентрации вируса гепатита В в крови больного.
Для выявления ДНК ВГВ в исследуемых образцах использовали наборы реагентов производства ЗАО «Вектор-Бест»: «Векто-ДНК-экстракция», «Вектогеп В-ДНК-ампли», «Векто-ДНК-ЭФ». В качестве стандартного контрольного образца использовали рекомбинантную плазмиду, полученную в лаборатории рекомбинантных белков ЗАО «Вектор-Бест». Амплификацию ДНК проводили с применением строго специфичных олигонуклеотидных праймеров, комплементарных участку S-гена ВГВ. Один из олигонуклеотидов-праймеров модифицировали биотином и получали в результате ПЦР меченный биотином ампликон. Для детекции амплифицированной вирусной ДНК проводили гибридизацию полученной ДНК со специфичным к ампликону ДНК-зондом, меченным флуоресцеин изотиоцианатом (ФИТЦ). Оптимальное время гибридизации 5 минут при температуре 60°С. Образовавшийся комплекс (зонд/биотинилированный ампликон) переносили на планшет для связывания его со стрептавидином, иммобилизованным в лунках планшета. Связавшийся ампликон выявляли конъюгатом антител к ФИТЦ, меченных пероксидазой хрена (АТ-ФИТЦ-П). В качестве хромогена использовали тетраметилбензидин. Считывание результатов на последней стадии ИФА осуществляли с помощью ридера-мультискана. Пробу считали положительной, если оптическая плотность (ОП) превышала 0,25 О.Е. Время детекции результатов ПЦР-анализа - 1,5 часа.
Чувствительность анализа определяли методом лимитирующих разведений с использованием очищенной рекомбинантной плазмиды, содержащей вставку участка генома ВГВ. Она составила 50 вирусных геном-эквивалентов (гэ) на пробу (или 500 гэ/мл) при специфичности анализа 100%. Чувствительность и специфичность анализа к различным субтипам ВГВ обеспечена выбором праймеров, общих к известным субтипам ВГВ. Для количественной оценки содержания ДНК ВГВ в исследуемых образцах использовали ряд внешних стандартов на основе рекомбинантной плазмиды с известной концентрацией. Линейная зависимость ОП (от 0,25 О.Е. до 3,50 О.Е.) от концентрации ДНК в анализируемых образцах получена в полулогарифмических координатах в пределах 5х102 - 1х105 гэ/мл ДНК ВГВ.
Таким образом, разработан метод высокочувствительного выявления ДНК ВГВ с использованием ПЦР и детекцией результатов энзимогибридизационным анализом на планшетах, что позволяет исключить применение электрофоретического оборудования, документировать результаты исследований в цифровом формате имеющимися во многих клинико-диагностических лабораториях ридерами-мультисканами. Применение в качестве метки ФИТЦ может позволить также использовать для детекции результатов флуориметры. Не менее важно то, что возможна количественная оценка содержания ДНК ВГВ в исследуемых сыворотках крови с применением внешних стандартных образцов.