Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт

Эта работа опубликована в сборнике научных трудов «Естествознание и гуманизм» (2006 год, Том 3, выпуск 1), под редакцией проф., д.б.н. Ильинских Н.Н. Посмотреть титульный лист сборника

В Российской Федерации лептоспироз является одной из наиболее распространенных инфекций. Наличие на территории страны значительного числа природных очагов и формирование стойких антропургических очагов лептоспироза создает постоянную угрозу возникновения заболевания людей и сельскохозяйственных животных.
Цель работы – разработка, совершенствование  биотехнологий производства иммунобиологических препаратов для диагностики лептоспироза и выявление его возбудителей.
При выполнении  работы использовали патогенные штаммы лептоспир: L. Pomona, L. Tarassovi, L. Grippotуphosa, L. Icterohaemorragiae, L. Canicola, L. Hebdomadies. Для получения бакмасс лептоспир культуры выращивали на среде Ферворта-Вольфа при 28+2 0С в течение 7-10 суток. В основу изолирования водорастворимых антигенов из 6 серогрупп патогенных лептоспир положен способ Е.Н. Афанасьева (1984). При иммунизации использовали схемы, разработанные И.С.Тюменцевой с соавт. (1994). Иммуноглобулины фракционировали ПЭГ-6000 (Polsen et al., 1964). Конъюгацию иммуноглобулинов с ФИТЦ проводили по H.Stortz (1987). Иммунофлуоресцентный анализ (ИФА) осуществляли по A.H.Coons, M.N.Kaplan (1950). Иммунопероксидазные конъюгаты получали методом перйодатного окисления по Р.K.Nakane, A.Kawaoi (1974) в модификации Е.А.Ткаченко (1982).Рабочий титр конъюгата определяли методом двойного антительного "сэндвича" по методике Clark, Adams (1977). Результаты учитывали на регистрирующем спектрофотометре "Multiscan" (Флоу лаб, Англия). При постановке количественного иммунофлуоресцентного анализа (КИФА) использовали люминесцентный микроскоп ЛЮМАМ Р-8, оборудованный фотометрической насадкой типа ФМЭЛ-14. Хемилюминесцентный иммуноанализ (ХЛИА) проводили согласно методических рекомендаций, разработанных в Волгоградском противочумном институте совместно с МГУ им. М. В. Ломоносова, утвержденных в 1991 г. МЗ СССР. Для постановки полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали диагностические наборы "Ниармедик" (Россия) и тест-систему Gene Pak. Магноиммуносорбенты (МИС) получали согласно нашим разработкам (Пат. №2138813 от 27.09.99 г).
На основе разработанных МИС сконструированы диагностикумы магноиммунносорбентные для выявления лептоспироза в ИФА, КИФА, ХЛИА, ПЦР. Сочетание магноиммуносорбентов с экспресс-анализами необходимо для повышения чувствительности, достоверности и воспроизводимости результатов.
Отработанные  методические приемы и условия сочетанного применения магноиммуносорбентов с методами экспресс-диагностики дали возможность максимального освобождения пробы от посторонней микрофлоры путём многократных промываний без потери выделяемых микроорганизмов при исследовании сильно загрязнённых проб (канализационные стоки, почва и т.д.), при этом отмечена высокая чувствительность МИС, позволяющая обнаруживать бактериальные клетки в пределах 1х102 - 1х10 3 м.к. в пробе, объём которых может достигать многих кубических метров жидкости; сократили время проведения анализов, связанное с ускорением манипуляций и исключением ряда этапов в ходе анализов. Так, например,   для ИФА  отпадает необходимость в полистироловых планшетах, а  срок годности иммобилизованной  твёрдой  матрицы,  то есть  МИС, достигает  несколько лет  против  20 дней иммобилизованных планшет, при увеличении чувствительности (МИС+ИФА) в 1000 раз по сравнению с традиционным ИФА. При использовании МИС с КИФА появилась возможность учитывать реакцию не только визуально, но и количественно (с помощью вольтметра), без приготовления мазков  и их фиксации при чувствительности, в 1000 раз превышающей традиционную РИФ. Постановка реакций ИФА И КИФА сократилась  до 60 мин.
Использование в качестве твердой фазы МИС в ХЛИА впервые позволило проводить исследование объектов внешней среды, так как  из-за серьезных фоновых помех, низкой концентрации патогена и наличия посторонней микрофлоры ХЛИА без МИС при исследовании таких проб не пригоден.  Использование МИС позволяет исключить необходимость иммунной сенсибилизации планшет и создать возможность применения для постановки реакции  стеклянных пробирок, что упрощает и удешевляет анализ.
Использование в ПЦР магноиммуносорбентов позволило максимально сконцентрировать микробные клетки и исключить отрицательное влияние на компоненты реакции всевозможных примесей различного происхождения, поскольку некоторые из них способны значительно снижать чувствительность ПЦР за счет угнетения активности термостабильной  ДНК-полимеразы.
На протяжении 1997-2005 г.г. на территориях Краснодарского и Ставропольского краёв проводились полевые испытания тест-системы полигрупповой диагностической лептоспирозной. В 1998 г она нашла успешное применение при локализации и ликвидации вспышки лептоспироза среди людей  и сельскохозяйственных животных в г.Абинске  Краснодарского края. При обследовании водоёмов, подозрительных на контаминацию патогенными лептоспирами, в 25 % случаев был выявлен положительный результат (Бинатова В.В. с соавт., 2001).  
Таким образом, сочетание магноиммуносорбентов с экспресс-анализами необходимо для повышения чувствительности, достоверности и воспроизводимости результатов, что возможно и связано со способностью МИС селективно концентрировать на своей поверхности искомый патоген из большого объёма жидкости, проводить эффективную отмывку проб от загрязнений, мешающих проведению индикационных реакций.

Используемая литература
1.    Афанасьев Е.Н. Сравнительная характеристика антигенной структуры бактерий рода Brucella. – Автореф. дисс. ... канд. мед. наук.-Саратов, 1984. - 20 с.
2.    Жарникова И.В., Тюменцева И.С., Ефременко В.И., Афанасьев В.И., Бинатова В.В. Способ получения иммуносорбента (варианты): Пат. №2138813 от 27.09.99 г. - Заявка №97119147/13 (020480) от 20.11.97 г.
3.    Ткаченко Е.А. Применение твердофазных иммуносорбентных методов (энзимного и радиоиммунологического анализа) для лабораторной диагностики аренавирусных инфекций, крымской геморрагической лихорадки и геморрагической лихорадки с почечным синдромом   //Методические рекомендации. - М., 1982. - 21 с.
4.    Тюменцева И.С., Жданова Е.В., Афанасьев Е.Н. Усовершенствование производственной схемы иммунизации животных моно- и поликомпонентными антигенами // Актуал. пробл. профилакт. ОО и природно-очаговых инфекц. болезней. - Иркутск, - 1994. - С. 92-93.
1.    Clark M.F., Adams A.N. Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant virus // J. Gen. Virol. - 1977. - Vol. 36. - N 3. - P. 475-483.
2.    Coons  A.H., Kaplan M.N. Localisation of antigen in tissue cells // J. Exp. med. - 1950. - Vol. 91. - N1. -  P. 81-89.
3.    Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase-labelled antibody - a new method of conjugation // J. Histochem. Cytochem. - 1974. - Vol. 22. - № 4. - P. 1084-1092.
4.    Polson A., Potgieter G.M., Largier J.E., Mears G.E.F., Joubert F.J. The  fractionation of protein mixtures by linear poolation of IgG from manalion serra with the acid of caprilic // Acch. of Biochem. Stray and Biophys. -  1969. - Vol. 139. - P. 279-284.