Эта работа опубликована в сборнике статей по материалам 70-й Юбилейной итоговой научной студенческой конференции им. Н.И. Пирогова (г. Томск, 16-18 мая 2011 г.), под ред. В. В. Новицкого, Л. М. Огородовой. − Томск: Сибирский государственный медицинский университет, 2011. − 430 с.

 

Скачать сборник (формат MS Word, 7,3 мб)

Посмотреть основную информацию о сборнике, обложку и т.д.

 

Актуальность. Препараты класса хинолонов являются препаратами резервного ряда в лечении туберкулёза. Их механизм действия принципиально отличаются от такового у других антимикробных препаратов, что обеспечивает их активность в отношении штаммов микроорганизмов, устойчивых к действию препаратов основной группы.

У Mycobacterium tuberculosis мишенью действия хинолонов является фермент ДНК-гираза, который в комплексе с ДНК образует участок связывания хинолонов. В результате действия хинолонов происходит остановка репликации [1].

Ведущим механизмом устойчивости к хинолонам у Mycobacterium tuberculosis является модификация ДНК-гиразы в результате мутаций в соответствующих генах и аминокислотных замен в молекуле фермента, которые приводят к снижению сродства хинолонов к ферментам и повышению минимальной подавляющей концентрации препаратов. Более всего снижают сродство и тем самым повышают устойчивость ферментов к препарату замены аминокислот в субъединице gyrА: аланина в положении 90 и аспарагина в положении 94, а также некоторые другие [2].

Цель: изучить изменение сродства хинолонов к ДНК-гиразе Mycobacterium tuberculosis при некоторых аминокислотных заменах путём вычисления энергии связывания хинолонов и модифицированных молекул фермента in silico.

Материалы и методы.  В настоящей работе использовались модели хинолонов (ципрофлоксацин, гатифлоксацин, ломефлоксацин, моксифлоксацин, оксифлоксацин, спарфлоксацин), доступные на сайте http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov, и модель нативной ДНК-гиразы Mycobacterium tuberculosis. С помощью программы Modeller из нативной модели были получены 9 моделей ДНК-гиразы с различными аминокислотными заменами.

Построение моделей «хинолонового кармана» и вычисление энергии связывания каждого хинолона с ДНК-гиразой проводилось с помощью программы AutoDock. Для каждой модели хинолон—фермент  было найдено 50 наилучших конформаций из 500 000, энергии связывания для каждой конформации и оптимальная энергия связывания для модели в целом.

Сперва определяли диапазон энергий и  оптимальную энергию связывания для каждого хинолона с нативной ДНК-гиразой, затем – оптимальную энергию связывания для тех же хинолонов с мутировавшим ферментом. Чем более отрицательна полученная энергия – тем сильнее связь между молекулами, и тем больше чувствительность фермента к препарату. Полученные in silico расчёты сравнивались с имеющимися литературными данными [3, 4].

Результаты. Сравнение полученных значений энергий связывания и имеющихся данных по устойчивости ферментов с заменами аминокислот к хинолонам позволило выявить некоторые закономерности (табл.1).  

В большинстве случаев для моделей ферментов с аминокислотными заменами, придающими повышенную устойчивость, оптимальная энергия связывания более положительна или незначительно меньше, чем максимальное значение энергии связывания для нативной молекулы. Для прочих моделей энергия связывания с хинолоном оказывается близка к энергии связывания с нативной молекулой, или даже более отрицательной – то есть фермент обладает гиперчувствительностью. Степень отклонения энергий не коррелирует со степенью устойчивости, выраженной в относительной МПК.

В некоторых случаях эти закономерности не проявляются, что можно объяснить действием других механизмов устойчивости, например, эффлюкса или ферментной инактивации.

Таблица 1. Взаимосвязь энергий связывания хинолонов с ДНК-гиразой в опыте и данных об устойчивости мутированных ферментов.

	Средняя энергия связывания						Устойчивость, МПК по отношению к нативному ферменту
	CFX	GFX	OFX	MFX	LFX	SFX	CFX	GFX	OFX	MFX	LFX	SFX
Native min	-6,76	-6,26	-6,61	-6,93	-6,52	-6,7
Native max	-5,55	-4,88	-5,32	-4,66	-5,35	-5,16
Native med	-6,18	-5,81	-6,43	-5,81	-6,12	-5,82	1	1	1	1	1	1
A90→V	-4,7	-4,55	-5,48	-4,24	-5,34	-4,44	8	4	8	8	8	4
N94 →G	-4,65	-4,9	-5,28	-5,01	-5,36	-4,6	ND	8	16	16	8	ND
N94 →Y	-5,27	-5,19	-5,48	-5,45	-5,73	-5,33	40	8	16	16	ND	10
N94 →H	-4,57	-4,96	-4,84	-4,36	-4,88	-4,67	15	8	16	4	16	8
A90 → V +D94→N	-4,69	-4,59	-5,37	-4,25	-5,37	-4,67	ND	>30	>50	>50	ND	ND
A90 → V	-5,06	-4,62	-5,46	-5,39	-5,35	-4,39	80	ND	>160	ND	ND	20
+S91 → P
T80 → A	-5,42	-4,76	-5,9	-6,88	-6,44	-4,65	ND	≤ 1	≤ 1	≤ 1	≤ 1	ND
T80 → A	-6,23	-5,63	-6,06	-5,9	-5,86	-5,55	ND	≤ 1	≤ 1	≤ 1	≤ 1	ND
+A90 →V
A90→G	-6,32	-6,14	-7,11	-6,52	-6,59	-6,19	ND	≤ 1	≤ 1	≤ 1	≤ 1	ND

 

Примечание: Аминокислоты указаны в международной однобуквенной кодировке;  → - замена, ND – нет данных.

 

Выводы: зная точку действия лекарственного препарата  и имея модели препарата и его мишени, можно с помощью программ Modeller и Autodock предсказать относительное направление (но не степень) изменения восприимчивости мишени при возникновении некоторой определенной мутации и аминокислотных замен, что позволяет говорить о возможной устойчивости фермента (и как следствие, микроорганизма) к этому препарату.