Эта работа опубликована в сборнике статей по материалам 70-й Юбилейной итоговой научной студенческой конференции им. Н.И. Пирогова (г. Томск, 16-18 мая 2011 г.), под ред. В. В. Новицкого, Л. М. Огородовой. − Томск: Сибирский государственный медицинский университет, 2011. − 430 с.

 

Скачать сборник (формат MS Word, 7,3 мб)

Посмотреть основную информацию о сборнике, обложку и т.д.

 

Актуальность. В последнее время в морфологии стал преобладать количественный подход в анализе как гистологических, так и электронно-микроскопических препаратов. Изображения, полученные с препаратов, подвергаются анализу, который включает определение различных характеристик клеток, таких как площадь, периметр, яркость, округлость и др. И часто приходится просчитать тысячи клеток, чтобы получить достоверные результаты. На обсчет изображений вручную уходит много времени, в связи с этим возникает потребность в оптимизации и автоматизации процесса. ImageJ (Image Processing and Data Analysis in Java) – программа, специально разработанная для анализа медицинских  и биологических изображений. Эта программа предоставляет пользователю широкий набор инструментов, с помощью которого можно реализовать точные количественные расчеты на биологических изображениях [1].

Перед нами стоял вопрос о количественных и качественных характеристиках искусственных поверхностей, способствующих остеогенной дифференцировке мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК). Мы изучали in vitro опосредованное влияние продуктов деградации кальцийфосфатных (КФ) покрытий на наноструктурной подложке, имитирующих состояние поверхности кости, на структурно-функциональное состояние культуры ММСК человека вне прямого контакта с искусственным материалом.

Цель: разработать модуль для полуавтоматизированной морфометрии параметров культуры ММСК, находящейся под влиянием продуктов деградации КФ покрытий.

Материалы и методы. Объектом исследования были металлические (титан, цирконий-ниобиевый сплав) диски с двусторонними биосовместимыми КФ покрытиями, нанесенными микродуговым способом в электролите, содержащем наночастицы гидроксилапатита (10-40 нм), а также с биоинертной (титаноксидной) поверхностью; источник ММСК человека – культура фибробластоподобных пренатальных клеток легкого человека (ООО “Банк стволовых клеток“, г. Томск).

Для расчета количественных характеристик ММСК был написан модуль для программы ImageJ, который позволяет получать интересующие нас характеристики в автоматизированном режиме, при этом выделение первичной области интересов (области изучаемой клетки и окружающего ее фона) производится экспертом.

 

Модуль представляет собой алгоритм последовательных действий, выполняемых программой:

1. Перевод цветного изображения в полутоновое 8-битное в связи с необходимостью использования функции «Порог» и отладка его контраста;
2. Установка  шкалы единиц  для измерения объектов не в пикселях, а в микрометрах;
3. Для работы эксперта был создан инструмент Круговое выделение области, предназначенный для выделения изучаемой клетки и окружающего фона;
4. Изменение калибровочной функции изображения для измерения оптической плотности пикселей;
5. После выделения при нажатии на активную клавишу программа должна была выполнять следующие действия:
   1. Применять к изображению гауссовский фильтр, определяющий границы клетки с окружающим материалом;
   2. Вычитать из фона частицы окраски и входящие в выделение соседние клетки;
   3. Рассчитывать характеристики клетки и фона (площадь, яркость, периметр, округлость, эллипсоидность);
   4. Рассчитывать оптическую плотность клетки по формуле: Плотность = lg(яркость фона/яркость клетки);
   5. Помечать посчитанную клетку.
6. Сохранение результатов измерений в таблице для дальнейшего анализа.

Результаты. Были определены  как функциональные (оптическая плотность при окраске на щелочную фосфатазу,  ЩФ)), так и морфологические клеточные показатели, в частности, площадь клетки (мкм²), округлость (индекс растет от 0 до 100 % идеального круга) и эллипсоидность ее формы (индекс более 1) [1]. Площадь свидетельствует о степени распластывания клетки на искусственной поверхности, уменьшение индекса округлости – о ее неправильной форме вследствие появления псевдоподий, эллипсоидность – об удлинении стромальной стволовой клетки при ее морфологическом созревании в фибробласты.  Увеличение оптической плотности ММСК при окраске на ЩФ позволяет предполагать их остеогенное коммитирование, т.к. накопление фермента считается маркером остеобластов [2].

Для верификации результатов, получаемых при помощи данного модуля, были использованы два способа подсчета параметров: с применением данного модуля (100 клеток) и с использованием субъективного выделения вручную (100 клеток) в одних и тех же образцах. Для сравнительного анализа результатов ручного подсчета и подсчета с помощью модуля была использована программа Statistica 6.0. Достоверных различий, согласно W-критерию Вилкоксона, не наблюдалось (p>0,05).

Таким образом, использование модуля подтверждает результаты ручного подсчета и значительно ускоряет работу, позволяя увеличить объем информации о морфофункциональном статусе клеток при их взаимодействии с искусственными биосовместимыми материалами. Разработанный модуль может быть использован для реализации расчетов в полуавтоматизированном режиме при участии эксперта-цитолога. Планируется использование данного модуля для подсчета других культур клеток с внесением характерных для них изменений.