|
Вятский государственный университет (г. Киров)
Эта статья опубликована сборнике научных трудов "Фундаментальные науки и практика" с материалами Третьей Международной Телеконференции "Проблемы и перспективы современной медицины, биологии и экологии" - Том 1 - №4. - Томск - 2010.
Лактобактерии являются представителями естественной микрофлоры организма человека и животных и играют важную роль в поддержании колонизационной резистентности [Шендеров, 2001; Н.А. Глушанова, 2003]. Они подавляют рост и размножение поступающих извне представителей посторонней микрофлоры, предотвращают их приживление. В организме человека лактобациллы появляются в первые дни после рождения и в течение всей его жизни присутствуют в кишечнике, препятствуя развитию гнилостных и патогенных микроорганизмов.
Развитие дисбактериоза в большинстве случаев связано с нарушением естественного состава микрофлоры кишечника. Представители рода Lactobacillus нашли свое применение в составе многочисленных лечебно-диетических кисломолочных продуктов и фармакопейных биопрепаратов [Д.С. Янковский и др., 2006; G. Giraffa et al., 2010]. Лактобактерии и продукты метаболизма широко используются для профилактики и лечения различных острых и хронических заболеваний пищеварительного тракта, способствуя восстановлению нормальной микрофлоры.
Лактобактерии широко используются в пищевой промышленности в составе заквасок для приготовления кисломолочных продуктов (сыры, масла, йогурты), для хлебопечения (ржаной хлеб), для квашения овощей и засолки рыбы, для приготовления сухих и варено-копченых колбас [K. Rantsioua et al., 2005].
Прежде чем использовать штаммы микроорганизмов (в том числе и лактобацилл) для промышленного производства необходимо определить их разнообразные характеристики, в том числе и генетические, которые в отличие от культурально-морфологических более стабильны. Классическими методами внутривидового типирования микроорганизмов являются изучение морфологии, биохимические тесты и серологические реакции. Но вышеуказанные методы обладают существенными недостатками: они опираются на выявление вариабельных фенотипических признаков, относительная однородность которых определяет трудности во внутривидовой дифференциации микроорганизмов и не позволяет выявить различия между штаммами одного вида. Для повышения достоверности результатов при типировании штаммов лактобацилл целесообразно наряду с классическими использовать молекулярно-генетические методы исследования [G. Spano et al., 2002; K. Han et al., 2005; D. Mohania et al., 2008].
Молекулярно-генетические методы исследования позволяют не только провести внутриродовую дифференциацию лактобацилл на основании особенностей их геномов, но и дают возможность получить индивидуальные генотипические характеристики каждого штамма.
Наиболее перспективными методами типирования штаммов лактобацилл, по нашему мнению, являются методы полимеразной цепной реакции (ПЦР). Одновременное применение нескольких методов ПЦР обеспечивает возможность генотипирования лактобацилл и позволяет решать задачи дифференциации видов и штаммов, входящих в состав пробиотических и производственных заквасок [L. Settanni et al., 2005; G. Blaiotta et al., 2008].
Целью нашей работы является разработка способа типирования штаммов лактобацилл с использованием методов полимеразной цепной реакции.
Предлагаемый нами способ предполагает типирование изолятов лактобацилл в три этапа:
1. Родовая идентификация при помощи ПЦР с праймерами на спейсерную область 16S-23S рибосомальной РНК (рРНК).
2. Видовая идентификация методом рестрикционного анализа межгенной спейсерной области 16S-23S рРНК.
3. Штаммовая дифференциация методом VNTR-анализа (variable number of tandem repeats).
В ходе исследований с использованием специализированного программного обеспечения произведен анализ нуклеотидных последовательностей спейсерных областей 16S-23S рРНК 65 штаммов лактобацилл, представляющих 14 распространенных видов: L. acetotolerans, L. acidophilus, L. amylovorus, L. brevis, L. buchneri, L. casei, L. delbrueckii, L. fermentum, L. helveticus, L. hilgardii, L. plantarum, L. reuteri, L. rhamnosus и L. sakei. Все последовательности были взяты из базы данных GenBank сервера NCBI − National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/). Для характерных представителей каждого вида было проведено выравнивание нуклеотидных последовательностей межгенных областей. Обработку данных проводили с помощью пакета программ DNASTAR (Lasergene Co., США).
1 − L. amylovorus I01; 2 − L. helveticus CCC B1186; 3 − L. acidophilus ATCC 4356; 4 − L. acetotolerans ATCC 43578; 5 − L. delbrueckii CCC B1044; 6 − L. casei ATCC 4913; 7 − L. rhamnosus ATCC 7469; 8 − L. buchneri ATCC 4005; 9 − L. hilgardii ATCC 8290; 10 − L. brevis ATCC 4006; 11 − L. fermentum ATCC 9338; 12 − L. plantarum ATCC 8014; 13 − L. reuteri ATCC 25744; 14 − L. sakei ATCC 15521; М − ДНК-маркер 100 bp + 1,0 Kb.
Рисунок 1. Электрофореграммы рестрикционных фрагментов при рестрикции амплификатов 14 штаммов лактобацилл эндонуклеазами AciI (а) и AluI (б).
Были выявлены участки гомологии, которые фланкировали вариабельные нуклеотидные последовательности ДНК. С помощью программы OLIGO v. 4.0 на участках ДНК с высокой гомологией были выбраны праймеры для амплификации спейсерных областей.
Принадлежность исследуемого изолята к роду Lactobacillus подтверждается в случае получения амплификата (продукта ПЦР) с длиной около 450 н. В реакционной смеси после амплификации помимо основного продукта обнаруживаются один или два минорных (менее ярко выраженных) продукта большей длины (около 600 н. и 730 н.). Появление минорных продуктов обусловлено неспецифическим отжигом праймеров, а также наличием в геноме лактобацилл двух копий спейсерной области 16S-23S рРНК: большой и малой. Продукт длиной около 450 н. характерен для малой спейсерной области, и именно он является одним из основных объектов нашей работы. Продукт амплификации большой спейсерной области не представляет для нас интереса, поэтому наличие неспецифических продуктов ПЦР минимизируется оптимизацией режима амплификации путем повышения температуры отжига.
С помощью пакета программ DNASTAR (Lasergene Co., США) были составлены карты рестрикции продуктов амплификации для рассматриваемых видов. Анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) осуществляется с использованием двух рестриктаз AciI и AluI. Для построения моделей электрофореграмм использовали резидентную программу DNA InSilicoGel сервера Кировская молекулярная биология (http://www.molbiol.kirov.ru/utilites/phoresis/). Модели электрофореграмм представлены на рисунке 1.
Использование ПДРФ-анализа продуктов амплификации с рестриктазами AciI и AluI позволяет получить различные ПДРФ профили для 12 видовых групп. Неразличимыми остаются два вида L. amylovorus и L. helveticus (дорожи 1 и 2, соответственно).
С целью выявления генетических различий между штаммами одного вида лактобацилл с использованием Internet и базы данных сайта GPMS – Genomes, Polymorphism and Minisatellites (http://minisatellites.u-psud.fr/) были изучены VNTR последовательности вида L. plantarum.
|
Таблица 1
|
|
Анализируемые VNTR-локусы L.plantarum
|
Физическая позиция, на хромосоме kb
|
Длина повтора, н.
|
Число копий
|
Общая длина, н.
|
Процент гомологии, %
|
|
1337
|
96
|
4,3
|
413
|
84
|
|
2295
|
33
|
8,3
|
272
|
88
|
|
2306
|
78
|
8,8
|
421
|
94
|
|
2538
|
75
|
5,1
|
380
|
82
|
|
2604
|
69
|
4,7
|
322
|
84
|
|
2632
|
45
|
8,9
|
401
|
87
|
|
2719
|
36
|
6,6
|
273
|
88
|
|
Для дальнейшей работы были отобраны 7 VNTR последовательностей (таблица 1). Данные области наиболее оптимально удовлетворяют требованиям, предъявляемым к VNTR типированию: достаточная длина повтора, повышенная копийность и возможность осуществления детекции продуктов амплификации в агарозном геле.
Следующим этапом работы стал выбор праймеров для выбранных локусов. С сервера GPMS были получены последовательности нуклеотидов VNTR локусов. Выбор праймеров осуществляли с помощью компьютерной программы OLIGO v. 4.0.
Был проведен VNTR анализ с парой праймеров на локус 2306. В анализе участвовали пробы ДНК четырех изолятов L. plantarum. Для трех проб ДНК изолятов был получен амплификат размером 490 н., а для ДНК изолята L. plantarum 911 − размер продукта расчетной длины 420 н. Отличия в размере продукта соответствуют длине одного VNTR-повтора для локуса 2306. Полученный результат свидетельствует о перспективности VNTR-анализа для штаммовой дифференциации лактобацилл.
Таким образом, обоснован способ многоуровневого типирования штаммов L. plantarum с использованием полимеразной цепной реакции. Дальнейшие исследования необходимо сосредоточить на отработке технологии рестрикционного анализа продуктов амплификации и типировании штаммов L. plantarum с использованием других VNTR-локусов.
Список литературы
Глушанова, Н.А. Биологические свойства лактобацилл / Н.А. Глушанова // Бюллетень сибирской медицины. − 2003. − №4. − С. 50 − 58.
Шендеров, Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Т. 3: Пробиотики и функциональное питание. − М.: Грантъ, 2001. − 288 С.
Янковский, Д.С. Бифидобактерии и лактобациллы как оптимальная основа современных пробиотиков / Д.С. Янковский, Г.С. Дымент // Современная педиатрия. − 2006. − Т. 3, №12. − С. 1 − 10.
Blaiotta, G. Lactobacillus strain diversity based on partial hsp60 gene sequences and design of PCR-restriction fragment length polymorphism assays for species identification and differentiation / G. Blaiotta, V. Fusco, D. Ercolini [et al.]. // Applied and Environmental Microbiology. − 2008. − Vol. 71, №1. − P. 208 − 215.
Giraffa, G. Importance of lactobacilli in food and feed biotechnology / G. Giraffa, N. Chanishvili, Y. Widyastuti // Research in Microbiology. − 2010. − Vol. 161. − P. 480 − 487.
Han, K. Rapid identification of Lactobacillus acidophilus by restriction analysis of the 16S–23S rRNA intergenic spacer region and flanking 23S rRNA gene / K. Han, Y. Kim, S. Choi [et al.]. // Biotechnology Letters − 2005. − Vol. 27. − P. 1183 – 1188.
Mohania, D. Molecular approaches for identification and characterization of lactic acid bacteria / D. Mohania, R. Nagpal, M. Kumar [et al.]. // Journal of Digestive Diseases. − 2008. − Vol. 9. − P. 190 − 198.
Rantsiou, K. Molecular characterization of Lactobacillus species isolated from naturally fermented sausages produced in Greece, Hungary and Italy / K. Rantsiou, E.H. Drosinos, M. Gialitaki [et al.]. // Food Microbiology. − 2005. − Vol. 22. − P. 19 − 28.
Settanni, L. Rapid differentiation and in situ detection of 16 sourdough Lactobacillus species by multiplex PCR / L. Settanni, D. Sinderen, J. Rossi [et al.]. // Applied and Environmental Microbiology. − 2005. − Vol. 71, №6. − P. 3049 − 3059.
Spano, G. Characterization of Lactobacillus plantarum from wine must by PCR species-specific and RAPD-PCR / G. Spano, L. Beneduce, D. Tarantino [et al.]. // Letters in Applied Microbiology. − 2002. − Vol. 35. − P. 370 − 374.
|
