Бирская государственная социально-педагогическая академия

Эта работа опубликована в сборнике научных трудов «Естествознание и гуманизм» (2005 год, Том 2, выпуск 3), под редакцией проф., д.б.н. Ильинских Н.Н. Посмотреть титульный лист сборника

Гемолимфа насекомых  как ткань внутренней среды играет  исключительно важную роль в жизнедеятельности организма. В ней сосредоточены и функционируют различные подвижные клеточные элементы – гемоциты, состав и количественное соотношение которых могут изменяться под воздействием внутренних и внешних факторов,  позволяя организму адаптироваться к условиям окружающей среды. Количество и соотношение клеток гемолимфы  в периферической крови определяется интенсивностью гемоцитопоэза  и процессами дальнейшей дифференциации  гемоцитов. Довольно подробно изучены процессы гемопоэза у позвоночных животных.  В то же время о наличии и организации органов кроветворения  у насекомых, а также о факторах, обуславливающих  то или иное направление дифференциации развивающихся клеток, в литературе имеются  весьма разноречивые сведения. Существовало мнение, что в постэмбриональный период  у насекомых отсутствуют локализованные очаги кроветворения, гемопоэз происходит диффузно, в гемолимфе,  за счет оставшихся  с зародышевого развития  недифференцированных клеток (Богоявленский,1932).  В тоже время у разных групп беспозвоночных животных  были описаны скопления мелких базофильных клеток, расположенные по ходу кровеносных сосудов, которым приписывалась кроветворная функция (Заварзин,1945).
В дальнейшем многие авторы подтверждают данное предположение. Гемоцитопоэтические органы были обнаружены на уровне дорсальной диафрагмы у  прямокрылых (Hoffmann,1970),  в области дорсального сосуда последних брюшных сегментов у личинок майского жука  (Brechelin, 1973), в перикардиальной полости и около аорты  у тополевого пилильщика (Запольских, 1979)  и у ряда других насекомых.
Серьезную и до конца не разрешенную проблему представляет вопрос о гистогенетических отношениях клеточных элементов гемолимфы и  последовательности дифференциации гемоцитов.  В данной работе предложен материал по изучению процессов дифференциации  клеточных элементов гемолимфы в постэмбриональный период развития шмеля Bombus terrestris (L)
Материал и методика
Для проведения исследования были взяты личинки  1-IV возрастов, белые  куколки и имаго земляного шмеля. Гемолимфу личинок получали путем укола  иглой в ложноножку, у куколок и имаго -  путем прокалывания спинного кровеносного сосуда в области брюшка. У личинок срезали кутикулу на спинной стороне тела, в области перикардия и прижимали поверхность предметного стекла к срезу, в результате этого на мазок попадали клетки, находящиеся в прикрепленном виде. Полученные мазки гемолимфы и мазки-отпечатки фиксировали смесью Карнуа,  метиловым спиртом и нейтральным формалином, затем окрашивали по Романовскому-Гимза и кислым гемалауном по Майеру. Для выявления ДНК использовали реакцию Фельгена, а также метиловый зеленый-пиронин для выявления ДНК и РНК.  Белки  окрашивали бромфеноловым синим, полисахариды определяли с помощью реакции ШИК, для выявления гликогена использовали раствор Люголя. Для выявления липидов и нейтральных жиров использовали судан черный В и судан красный III.  Цитохимический анализ проводили с ферментативным контролем.   
Результаты и обсуждение
В гемолимфе  земляного шмеля B. terrestris в соответствии с классификацией Сиротиной М.И. и Черной Г.С. (1965) нами были выделены следующие типы гемоцитов: прогемоциты, макронуклеоциты, фагоциты, сферулоциты и эноцитоиды. Исследования показали, что в ходе онтогенеза количественное соотношение данных типов гемоцитов  изменяется в зависимости от стадии развития насекомого и определяется процессами гемоцитопоэза.  Полученные нами мазки – отпечатки перикардиальной полости личинок земляного шмеля, позволили определить наличие участков, представляющих скопление  довольно крупных клеток (до 9мкм), с относительно слабо конденсированным  хроматином в ядре. По морфологическим особенностям они сходны с фрагментами гемоцитотворной ткани тополевого пилильщика (Запольских, 1979). Такие клетки способны к активному митотическому делению и, по-видимому, являются предшественниками прогемоцитов. Клетки, обнаруженных   фрагментов кроветворной  ткани морфологически однородны и могут быть определены как гемоцитобласты. При дальнейшем их развитии образуются  прогемоциты, которые  отличаются  меньшими размерами (6.5-7.5 мкм)  и более высокой степенью базофильности цитоплазмы.  Клетки имеют довольно крупное ядро. У прогемоцитов личинок хроматин  ядра мелкозернистый, у куколок и имаго хроматин выявляется иногда в виде плотного клубка.  В цитоплазме прогемоцитов шмелей обнаружено высокое содержание РНК и белка, жировые капли и включения гликогена не встречаются.
Прогемоциты циркулирующие в гемолимфе, сохраняют способность к митозу и дальнейшей дифференциации. Число делящихся прогемоцитов составляет у личинок 1 возраста 5-6%, затем наблюдается снижение митотической активности до 3-4% у личинок 3 возраста и до 2% у белых куколок. На стадии имаго митотический индекс равен 1%.  В гемолимфе шмеля, особенно у личинок ранних возрастов, можно наблюдать образование скоплений  молодых гемоцитов, содержащих делящиеся прогемоциты и клетки, находящиеся на разных стадиях дифференциации.  Наличие большого количества промежуточных форм между прогемоцитами и другими группами дифференцированных гемоцитов, позволяет считать их источником развития всех специализированных клеток гемолимфы. Наши наблюдения вполне согласуются с предположением  о происхождении всех типов гемоцитов от единой первоначальной клетки (Price and Ratcliffe, 1974).      
Исследование процессов  формирования  зрелых клеток  гемолимфы у личинок шмеля показало, что дифференциация  гемоцитов происходит в двух направлениях с развитием нескольких линий клеток.

Первое направление связано с образованием двух линий  клеток: микрофагоцитов и сферулоцитов. Микрофагоциты представляют собой наиболее мелкие  фагоциты личинок и белых куколок шмеля, длина их клетки не превышает 10.5 мкм.  Для дифференциации  микрофагоцитов характерно изменение конденсации хроматина в ядре, который представлен относительно крупными хроматиновыми глыбками,  и изменение формы клетки, она становится овальной или веретеновидной. В цитоплазме появляются вакуоли, их содержимое дает положительную реакцию на белки и полисахариды,  иногда обнаруживаются жировые включения.
При образовании сферулоцитов  в околоядерной области цитоплазмы,   формируются две или три сферические вакуоли с белковым содержимым или белковыми гранулами. Накопление массы цитоплазмы  сферулоцитов идет постепенно, одновременно с процессами дифференциации, поэтому у молодых сферулоцитов,  имеющих небольшую величину, уже появляются  сферические  вакуоли, размеры которых увеличиваются пропорционально размерам клетки. Хроматин ядра принимает нитевидную структуру, хроматиновые  глыбки четко не прсматриваются. У зрелых сферулоцитов ядро  смещается и, обычно, расположено эксцентрично. В конце развития личинки сферулоциты исчезают и в гемолимфе предкуколок не обнаруживаются.
При другом направлении развития  прогемоцитов личинок и белых куколок происходит формирование  макронуклеоцитов (рис. 1,б), которые в гемолимфе личинок составляют довольно многочисленную группу клеток. Макронуклеоциты представляют собой клетки с крупным ядром и относительно небольшим объемом цитоплазмы. Появление в гемолимфе  макронуклеоцитов  связано с интенсивностью процессов  дифференциации  клеток. Существует предположение  о том, что у разных насекомых длительность процессов  развития  прогемоцитов  различна, например, у пчел и муравьев развитие прогемоцитов идет быстрыми темпами  и молодые формы специализированных гемоцитов  уже имеют заметные характерные  особенности, позволяющие выделять их как определенный тип клеток. У личинок земляного шмеля, прогемоциты, вступившие на путь дифференцировки, сохраняя малую степень дифференциации, заметно  увеличиваются в размерах  и переходят  в следующую стадию развития  - макронуклеоциты, которые  в дальнейшем образуют ряд специализированных клеток гемолимфы. Такая поздняя дифференциация  характерна  для тех гемоцитов, которые должны  иметь  к началу дифференциации  значительный  объем  цитоплазмы (Запольских, 1987).
Изучение морфологии  макронуклеоцитов личинок и белых куколок  земляного шмеля показало, что они  сохраняют признаки малой дифференциации: ядерно-цитоплазматическое соотношение, характерное для прогемоцитов,  плотно-зернистую структуру  хроматина, интенсивную базофилию клетки, свидетельствующую о высокой концентрации РНК, способность к митотическому делению.  Митотический индекс макронуклеоцитов равен 1-2%. Эти особенности морфологии макронуклеоцитов, общие для всей системы малодифференцированных гемоцитов,  позволяют отнести  их  в группу пролиферирующих  клеток. Но по сравнению с прогемоцитами,  макронуклеоциты  имеют более высокую степень дифференциации, на это указывает  появление в цитоплазме вакуолей, содержащих полисахариды и липиды, а также наличие способности  к образованию цитоплазматических отростков,  определяющих фагоцитарные функции. Дальнейшая дифференциация макронуклеоцитов личинок приводит к образованию двух типов гемоцитов: фагоцитов и эноцитоидов.  Макронуклеоциты  образуют при дифференциации  веретеновидные и амебоидные фагоциты..
Для дифференцирующихся фагоцитов личинок и белых куколок характерно изменение формы и размеров клеток. Веретеновидные фагоциты   приобретают удлиненную форму, с двумя цитоплазматическими отростками, длина и форма которых может быть различна. Длина  клетки  достигает 16 мкм. Форма амебоидных фагоцитов более разнообразна и определяется  количеством и формой  многочисленных цитоплазматических отростков. Зрелые клетки крупные, около 18 мкм в диаметре.
 В ходе дифференциации фагоцитов ядро приобретает зернистую  структуру, с немногочисленными хроматиновыми глыбками и тремя ядрышками. В цитоплазме формируется система вакуолей, особенно хорошо  развитая у амебоидных фагоцитов. Большая часть мелких вакуолей расположена в периферической области клетки, где они собраны в группы. Содержимое вакуолей дает положительную реакцию на белки, иногда обнаруживаются полисахариды. В зрелых фагоцитах наблюдается появление  гранул гликогена. Постоянными компонентами цитоплазмы являются жировые капли, более крупные у амебоидных фагоцитов, они обнаруживаются, в основном, в периферических частях цитоплазмы, где также сконцентрированы сложные белковые комплексы в виде липопротеидов и гликопротеидов. В гемолимфе белых куколок земляного шмеля в результате дифференциации макронуклеоцитов образуется особый  класс фагоцитов – макрофагоциты, которые не встречаются в гемолимфе личинок. Макрофагоциты были обнаружены у ряда насекомых и определены как  клетки участвующие в гистолизе  личиночных тканей (Запольских, 1979).  Молодые макрофагоциты имеют округлую или овальную форму, зрелые  клетки приобретают амебоидную форму, с короткими  и мощными цитоплазматическими отростками. У зрелых клеток небольшое мелкозернистое ядро часто располагается эксцентрично и не всегда хорошо просматривается в интенсивно окрашенной цитоплазме. В процессе дифференциации и роста клетки происходит накопление в цитоплазме большого количества белково-углеводных и жировых включений. В ходе роста макрофагоциты могут достигать 40 мкм  в диаметре.   
В процессе дифференциации  эноцитоидов, которые встречаются только в гемолимфе  личинок  шмеля  B. terrestris, наблюдается довольно характерное  изменение структуры ядра.  У молодых эноцитоидов ядро занимает центральную часть клетки, хроматин конденсируется в глыбки овальной формы, расположенные в ядре равномерно. У зрелых клеток глыбки четко выражены,  их число  не менее 14. В цитоплазме молодых эноцитоидов обнаруживается высокое содержание РНК, которое снижается  в процессе дифференциации клетки и остается  высоким лишь в периферической области.  Перинуклеарное пространство эноцитоидов слабо окрашивается азур-эозином,  вероятно здесь, как и у большинства перепончатокрылых насекомых, сконцентрированы органоиды: митохондрии и аппарат Гольджи. (Devauchelle, 1971). В периферической  зоне цитоплазмы эноцитоидов начинают накапливаться  мелкие вакуоли, которые постепенно заполняют всю цитоплазму, в их содержимом  выявляются белки. Жировые включения в цитоплазме эноцитоидов отсутствуют. Встречаются мелкие зерна гликогена, изредка белковые гранулы.
Изучение состава гемоцитов куколок и имаго земляного шмеля показало, что   в гемолимфе темной куколки происходит полная смена личиночных гемоцитов на имагинальные. У имаго земляного шмеля  прогемоциты   являются источником развития двух  типов клеток гемолимфы: фагоцитов и сферулоцитов. Макронуклеоциты, выявленные в гемолимфе личинок, у имаго не обнаруживаются, что  связано с более высокой скоростью процессов дифференциации прогемоцитов и образования специализированных клеток у имаго, по сравнению с личинками. С быстро протекающими процессами диференциации прогемоцитов возможно связано уменьшение  митотического индекса у имаго до 1%. Вероятно, у имаго регенерация  прогемоцитов обеспечивается в большей степени  клетками кроветворной ткани.
Для дифференцирующихся фагоцитов и сферулоцитов имаго шмеля по существу характерны те же  изменения структуры, какие мы наблюдали у соответствующих типов гемоцитов личинок.

Таким образом, изменение количественного соотношения форменных элементов крови  связано с процессами их образования и дифференциации. Общим источником развития специализированных клеток гемолимфы  у шмелей является система малодифференцированных клеток, что характерно и для других групп животных.  Увеличение числа клеток гемолимфы  может происходить  как за счет образования новых клеток в кроветворных органах, так и  путем  митотического  деления  малодифференцированных гемоцитов в циркулирующей  гемолимфе.  Данные процессы способствуют сохранению постоянного состава гемоцитов  на уровне, необходимом  для нормальной жизнедеятельности организма и  адаптации его к изменению условий окружающей среды.            

ЛИТЕРАТУРА
Богоявленский К.С. О форменных элементах крови насекомых. // Арх.  анат., гистол., эмбриол. – 1932.- 11, 2.- с.361-387.
Заварзин А.А. Очерки эволюционной гистологии  крови и соединительной ткани. -  Медгиз,  М. 1945. - 1-218.
Запольских О.В. Дифференциация форменных элементов гемолимфы тополевого пилильщика  (Heterarthrus ochropodae) в постэмбриональный период // Зоол.ж.- 1979.-т.58, 4.- с.509-514.
Запольских О.В. Сравнительная характеристика клеток гемолимфы  минирующих пилильщиков  рода Heterarthrus (Hymenoptera, Tenthredinidae) // Зоол. ж. – 1987. – т.66,5. – с.717-723.
Сиротина М.И., Черная Г.С. Анализ гемолимфы вредителей //  В кн. «Надзор, учет и прогноз массовых размножений  хвое – и  листогрызущих вредителей в лесах СССР. – М. – 1965. – с.137-170.
Brechelin M.  Presence d un tissu hematopoietique chez le coleoptere Melolontha melolontha (L.) // Experientia. – 1973. – Vol.29, 12. – 1539-1540 .
Devauchelle G. Etude ultrastructurale  des hemocytes du coleoptere   Melolontha melolontha (L.) // J/ Ultrastruct. Res. – 1971/ - Vol. 34, 5-6/ - p. 492-516.
Hoffmann J. Les organes hematopoietiques de deux  insectes  orthopteres: Locusta migratoria et Grullus bimaculatus  // Z. Zellforsch. – 1970. – Bd.106, 3. - p. 451-472.   
Price C.D., Ratclife N.A. Correlation  of  light  and electron  microscopic  hemocyte  structure  in the Dyctioptera  // О.Morphol., 144, 4. –  p. 485-497.