Labirint.ru - ваш проводник по лабиринту книг
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -ГлавнаяОб АльманахеРецензентыАрхив телеконференций- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -Сборники АльманахаДругие сборникиНаучные труды- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -Образец оформленияИнформационное письмоО проведении телеконференции- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -Материалы I телеконференцииМатериалы II телеконференцииМатериалы III телеконференцииМатериалы IV телеконференцииМатериалы V телеконференцииМатериалы VI телеконференцииМатериалы VII телеконференцииМатериалы VIII телеконференцииМатериалы IX телеконференцииМатериалы Х телеконференцииМатериалы XI телеконференцииМатериалы XII телеконференцииМатериалы XIII телеконференцииУчастники XIII телеконференцииМатериалы XIV телеконференцииУчастники XIV телеконференцииЮбилейная XV Телеконференция Октябрь 2014Участники Юбилейной XV Телеконференции- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -Конференция СМПиЧ-2015Участники СМПиЧ-2015- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -КонтактыФорум
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -Поиск по сайту

Последние статьи

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ЛИМФОЦИТОВ У БОЛЬНЫХ ИКСОДОВЫМ КЛЕЩЕВЫМ БОРРЕЛИОЗОМ ВЛИЯНИЕ ВИРУСНОИ ИНФЕКЦИИ КЛЕЩЕВЫМ ЭНЦЕФАЛИТОМ НА ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ПРЕДИКТОРЫ БОЛЕЗНИ РОЛЬ ГЕНА GSTM1 В ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЯХ КЛЕТОК КРОВИ и ПАТОЛОГИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЯХ СПЕРМАТОЗОИДОВ ПРИ ГРАНУЛОЦИТАРНОМ АНАПЛАЗМОЗЕ ЧЕЛОВЕКА ГЕНЕТИЧЕСКИИ ПОЛИМОРФИЗМ И ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ Т- ЛИМФОЦИТОВ У БОЛЬНЫХ АРТРИТОМ, АССОЦИИРОВАННЫМ В КЛЕЩЕВЫМ БОРРЕЛИОЗОМ КЛИНИЧЕСКИЕ ПОСЛЕДСТВИЯ ИКСОДОВОГО ВЕСЕННЕ-ЛЕТНЕГО КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫИ СТАТУС И АДАПТИВНЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ ОРГАНИЗМА ПЕРВОКЛАССНИКОВ ШКОЛ г. НЕФТЕЮГАНСКА ТЮМЕНСКОИ ОБЛАСТИ Материалы трудов участников 14-ой международной выездной конференции русскоязычных ученых в Китае (Sanya, Haynan Island) "Современный мир, природа и человек", том 8, №3. ПРОЛИФЕРАТИВНЫЕ И АПОПТОТИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В ЛИМФОЦИТАХ КРОВИ БОЛЬНЫХ ИКСОДОВЫМ КЛЕЩЕВЫМ БОРРЕЛИОЗОМ В ПРОЦЕССЕ СТИМУЛЯЦИИ АНТИГЕНОМ БОРРЕЛИИ THE ANALYSIS OF SOME INDICES OF IMMUNERESPONSE, DNA REPAIR, AND MICRONUCLEI CONTENT IN CELLS FROM TICK-BORNE ENCEPHALITIS PATIENTS КОМПЬЮТЕРНЫИ СПЕКТРАЛЬНЫИ МОРФОМЕТРИЧЕСКИИ АНАЛИЗ МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТОК ПЕРИФЕРИЧЕСКОИ КРОВИ У БОЛЬНЫХ ИКСОДОВЫМ КЛЕЩЕВЫМ БОРРЕЛИОЗОМ И ГРАНУЛОЦИТАРНЫМ ЭРЛИХИОЗОМ ЧЕЛОВЕКА

Полезная информация

 
 

БИОТЕХНОЛОГИЯ В СИНТЕЗЕ БЕТАЛАКТАМНЫХ АНТИБИОТИКОВ ПЕНИЦИЛЛИНОВОГО РЯДА

Печать E-mail
Автор Омарова Р. А., Бошкаева А. К., Шакиев С.Ш.   
22.05.2010 г.
Эта работа опубликована в сборнике статей с материалами трудов 2-ой международной телеконференции "Проблемы и перспективы современной медицины, биологии и экологии". Название сборника "Фундаментальные науки и практика Том 1, №2"

Посмотреть обложку сборника

Скачать информацию о сборнике (в архиве: обложка, тит. лист, оглавление, список авторов)

 
Казахский национальный медицинский университет им. С.Д. Асфендиярова, г. Алматы

Уже сегодня можно с уверенностью утверждать, что эффективное промышленное получение полезных веществ в мягких, экологически безопасных условиях практически невозможно без применения биокатализа: синтез широкого круга природных и тем более неприродных соединений возможен исключительно в рамках ферментной биотехнологии. Уникальная специфичность и стереоселективность действия ферментов, возможность проведения процессов в «мягких» условиях, протекание реакций с высокой скоростью при использовании незначительных количеств катализатора, практическое отсутствие побочных реакций – все это делает биокаталитические процессы чрезвычайно привлекательными и перспективными с технологической точки зрения.
В настоящее время биокаталитическая технология в синтезе беталактамных антибиотиков является ферментативно управляемым процессом роста, биосинтеза или биотрансформации культуры Penicillinum сhrysogenum. Преимущество биотехнологий, применяемых в синтезе подобных веществ, заключается в использовании ферментов – сверхмощных катализаторов достаточной степени специфичности, применение которых приводит к увеличению выхода и получению более чистых продуктов, чем в химических технологиях. В связи с высоким биокаталитическим потенциалом пенициллинацилаз особый интерес приобретает изучение структуры и функции, стабильности и активности этих ферментов.
Для успешного осуществления биокатализа в лабораторных условиях основными направлениями наших исследований являются: 1) получение фермента пенициллинацилазы, продуцируемой бактериями Escherichia coli; 2) получение экстракта из поверхностной культуры; 3) анализ экстракта на определение содержания редуцирующих веществ, белка, золы, активности фермента; 4) диализ ферментного раствора; 5) микробиологический синтез природного пенициллина без использования предшественников с оптимизацией сред культивирования продуцентов; 6) выделение пенициллина из культуральной жидкости.
Известно, что основой для получения полусинтетических антибиотиков, служат природные пенициллины, например такие, как бензилпенициллин (Pen G). Основные направления совершенствования биокаталитической технологии получения антибиотиков связаны с оптимизацией условий культивирования микроорганизмов-продуцентов. Важным продуцентом для биосинтеза пенициллинов являются лучистые (плесневые) грибы – различные виды рода Penicillium. 
Введение в питательную среду специфических веществ для обеспечения направленного синтеза антибиотиков беталактамного ряда нашло широкое применение при биосинтезе различных форм пенициллинов.  Существуют несколько методов получения антибиотиков с помощью микробиологического синтеза: 1) биосинтез пенициллина с помощью меченых соединений; 2) биосинтез пенициллина без предшественников; 3) биосинтез пенициллина на базе углеводов гидролизатов древесины; 4) способ стимулирования биосинтеза антибиотиков в присутствии активатора «натриевая соль [поли- (2,5-ди-гидрокси-фенилен)]-4-тиосульфокислоты».
Исследование биосинтеза пенициллина с помощью меченых соединений позволило установить, что формирование молекулы осуществляется за счет содержащихся в питательной среде аминокислот (l-цистеина, валина) и соответствующих предшественников.  При производстве бензилпенициллина предшественником служит фенилуксусная кислота или ее производные. Химическая структура предшественников сходна с соответствующим данному антибиотику радикалу в положении «6» 6-аминопенициллановой кислоты  [6].                        
Наиболее распространенным методом является обычный биосинтез в среде Чапека, который в сравнении с  методом, использующим меченые соединения, допускает выращивание культуры в определенной ферментационной среде без предшественников [7].   Нами представляется биосинтез пенициллина без использования предшественников. Этот метод является наиболее приемлемым в наших лабораторных исследованиях. Оптимизация состава культуральной среды Чапека, обеспечивающей повышенную продуктивность штаммов-продуцентов пенициллина, определяют научную новизну представленной работы.
Возможности и достоинства биокатализа были продемонстрированы нами при модификации полусинтетических антибиотиков-пенициллинов с использованием ПА, катализирующих селективный гидролиз и синтез амидной связи природного пенициллина. На настоящий момент нами изучается фермент пенициллин G ацилаза из Escherichia coli. Дальнейшие исследования заключаются в проведении процесса ферментативного гидролиза пенициллина с участием ферментов ПА с последующим образованием 6-аминопенициллановой кислоты, и получения новых производных полусинтетического ряда. Ферментативный синтез антибиотиков пенициллинового и цефалоспоринового ряда, осуществляемый под действием ферментов, специфичных пенициллинацилаз, получаемых из различных культур микроорганизмов, описан в работах [1-3],  а под действием других ферментов из класса гидролаз, например, синтетаз из E. сoli описан в работах [4;5].
Потенциальное использование Escherichia coli  [8] в качестве исходного материала для получения фермента пенициллинацилазы дает нам возможность провести периодическое культивирование микроорганизмов на искусственных питательных средах с целью диагностики и изучения их в биотехнологических целях.
Для получения пенициллинацилазы использовались питательные  среды с МПА, подвергаемые качественному и количественному контролю с использованием музейных штаммов в соответствии с действующими НТД. Музейные штаммы  микроорганизмов приобретены в Институте Микробиологии РК.
Последующим этапом наших исследований является получение фермента экстракта пенициллинацилазы из поверхностной культуры Еscherichia coli. Желательно взять готовую поверхностную культуру Escherichia coli влажностью 10-12% двух или трех продуцентов ферментов.

        Готовим экстракт ферментов в лабораторных экстракторах (диффузорах) простым настаиванием. Для приготовления экстракта берут 450 г воздушно-сухой массы культуры Escherichia coli (по 150 г культуры в  три экстрактора), добавляют к ней 3 дм3 воды очищенной, подогретой до 300 С, тщательно все перемешивают. Объем воды, рассчитанный на каждое эстрагирование, составляет 0,5 дм3  в шести повторностях. Масса сжимается небольшим весом тяжести и оставляется для настаивания на 15 мин. После этого смесь фильтруют через два слоя марли и слегка отжимают. При таком способе удалось отделить 1,2-1,5 дм3 фильтрата. Этот фильтрат используют для  повторного настаивания на свежей культуре во втором диффузоре, которую добавляют в фильтрат в количестве 150 г.  После настаивания смесь снова фильтруют и отбирают 0,6-0,7 дм3 второго фильтрата. Вновь повторяют настаивание, внося на второй фильтрат 150 г свежей культуры в третьем диффузоре. Объем третьего фильтрата обычно превышает 0,25-0,30 дм3. Содержание сухих веществ в таком экстракте составляет около 10%.


Экстракт из поверхностной культуры содержит значительное количество мутной взвеси.  Центрифугировав при частоте вращения 5000 мин-1,  проводим несколько раз декантацию от осадка.
Анализ исходного экстракта проводится на основании известных методов определении белка в пробах, содержания различных сахаров в растворах, содержания фосфора, ферментативных активностей в растворах.
В таблице 1 на основе трех повторных анализов, анализированы результаты среднего содержания этих показателей. 

Таблица 1 - Характеристика исходного экстракта

рН экстракта

Содержание

Активность ферментов

редуцирующих веществ

белка

золы

 

ед. ФА на 1 г сухого вещества

 

 

мг/см3

 

мг/см3

 

мг/см3

6,3

32,57

0, 96

0,48

 

31,25


Приведенные результаты анализа свидетельствуют о нормированном содержании представленных показателей состава ферментного препарата, изолированного методом экстрагирования культуры Escherichia coli.  Все биохимические методы исследования ферментного препарата,  содержащего пенициллинацилазу, опробованы известными методиками определения, существующими по литературным данным. 
Последующий анализ раствора ферментного препарата, подвергаемого очистке, сводится к процессу разделения  низко- и высокомолекулярных веществ с использованием полупроницаемых перегородок (мембран). Этот принцип заложен в основу использования метода диализа.

Последней стадией получения ферментных препаратов является концентрирование ферментных растворов. Традиционным способом концентрирования ферментных растворов служит вакуум-выпаривание. В связи с тепловой инактивацией ферментов выпаривание на вакуум-выпарных установках вели при низких температурах кипения растворов.  Полученный концентрат охлаждают до 2-30 С. Осаждение ферментов органическими растворителями (ацетоном) проводили до -5+-100 С при соотношении объемов раствора фермента и осадителя (1:2,0) и различных значениях рН (2,5; 4,0; 5,0; 6,0; 7,5; 9,0). Осаждаемый раствор подвергают высушиванию до постоянной массы при 1050С на 3-4 часа. Пересчитывают полученную величину высушенного осадка на 100 см3, находим выход продукта около 96%. 


Другим направлением наших исследований является  культивирование продуцентов рода Penicillium, позволяющий приспособить микробиологический синтез для получения природного пенициллина и без применения предшественников. Выход полученного продукта составляет немалый процент. Представлены результаты подбора питательной среды, с засевом посевных материалов культуры. Оптимизирован состав посевной питательной среды.  Целесообразно добавлять моно- и диаммониевые фосфаты, которые служат источником азота и фосфата, а также выполняют роль буфера. Фосфор выполняет важную роль в углеводном и липидном обмене. Натриевые и калиевые соли щелочных металлов  используются  для регулирования кислотно-щелочного  баланса. Калий необходим для превращения углеводов в процессе химических реакции и синтеза клеточных веществ. Магний является активатором ряда ферментов (пептидазы). Натрия хлорид обеспечивает изотоничность среды и физико-химические превращения в бактериальной клетке. Аммонийные соли органических кислот потребляемые микроорганизмами, вызывают умеренную кислотность среды и благоприятно влияют на процессы питания. Сера входит в состав аминокислот цистина и метионине, участвует в окислительно-восстановительном процессе и в клеточном дыхании.
Микробная клетка – продуцент определенного биологически активного соединения – несомненно, главный компонент в процессе микробного синтеза. В пределах одного вида наблюдаются довольно значительные штаммовые отличия. Главным критерием полезности продуцента является его активность, способность к сравнительно высокому накоплению искомого вещества. От выбора продуцента зависит весь технологический процесс производства от получения до очистки и выделения конечного продукта.  Активный продуцент пенициллина -  вид Penicillinum Chrysogenum (штамм 194), выявленный из  рода Penicillium, используется в качестве посевного материала для микробиологического синтеза природного пенициллина. Культуру выращивали при  температуре 24-260С  на круговой мешалке с 200-230 об/мин на искусственной среде следующего состава (%): азотнокислый аммоний – 1,0; однозамещенный фосфорнокислый калий – 0,6; сульфат натрия – 0,15; сульфат магния – 0,075; сульфат меди – 0,0005; сульфат марганца – 0,004; сульфат железа – 0,04; сульфат цинка – 0,004; тиосульфат натрия – 0,3; уксусная кислота – 0,45; глюкоза – 1,5; лактоза – 7,0; фенилуксусная кислота – 0,3-0,5 дробно в 3-5 приемов. рН 6,6-6,8 устанавливали путем добавления натрия гидроксида.
 Ферментационные среды засеваются 12-15% (объемными процентами) посевного   мицелия Penicillinum Chrysogenum. Регулируемый процесс ферментации ведется для получения природного пенициллина, высоко устойчивого по отношению к соляно-кислому содержимому желудочного сока.
         Состав ферментационной среды по методу Чапека  (в граммах):

   Сахароза – 30,0

     NаNO3 – 2,0

    KCl – 0,5

    KH2PO4 – 0,5

    MnSO4 – 1,0

        Условия стерилизации – 1 атм, 30 мин., 1000С.

Процесс биосинтеза пенициллинов происходит в асептических условиях, с термостатированием при температуре 28-300С в течение 7-8 дней и должен сопровождаться постоянным перемешиванием. Наличие жира в питательной среде оказывает пеногасящее действие и одновременно стимулирует процесс биосинтеза пенициллинов. Условия стерилизации  в среде Чапека - 1 атм., 30 мин, 100°С. Пенициллин выделяется в культуральную жидкость.


Антибиотики выделяют из культуральной жидкости экстракцией различными органическими растворителями или при различных значениях рН среды. Перед выделением антибиотика из культуральной жидкости отделяли твердую, или плотную фазу полученной биомассы от жидкой. В этих случаях, использовали фильтрацию. Затем проводили подщелачивание культуральной среды, т.е. обработали ее так, чтобы антибиотическое вещество переходило в ту фазу, из которой затем он будет наиболее полно выделен.
Очистку культуральной жидкости и выделение из нее пенициллина последовательно проводили способом замены растворителя  [9].      
Очистку антибиотика-сырца осуществляли перекристаллизацией. Растворение  вели при кипячении в колбе с обратным холодильником. Растворитель брали в количестве из расчета, что в литре  при нагревании растворяется около 200 г вещества.  Растворитель не должен растворять  примеси  (тогда их можно будет отфильтровать). Выделенный кристаллический антибиотик подвергали тщательному биологическому и химическому контролю.
Для проверки антимикробного действия вещества использовали тест-микроорганизмы:  Streptococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Escherichia coli.  Определение антимикробного действия  полученного вещества проводили методом диффузии на кровяном агаре (Streptococcus faecalis) и МПА (Staphylococcus aureus, Escherichia coli).
Культуральную жидкость закапывали в лунки на средах с тест-культурами. Установлено, что культуральная жидкость обладает антимикробной активностью в отношении Streptococcus faecalis, а ингибирования роста культур Staphylococcus aureus, Escherichia coli не отмечено, что соответствует литературным данным. Известно, что культура  
Staphylococcus aureus вырабатывает β-лактамазу. Зона подавления роста Streptococcus faecalis равнялась 19 мм, что является доказательством наличия в культуральной жидкости пенициллина.
Стандартизация препарата проводилась по требованию Государственной Фармаопеи (ГФ) Республики Казахстан, согласно которой лекарственный препарат «Бензилпенициллин натрия» содержит не менее 96,0 % и не более 102,0 % натрия (2S,5R,6R)-3,3-диметил-7-оксо-6-[(фенилацетил)амино]-4-тиа-1-азабицикло[3.2.0] гептан-2-карбоксилата в пересчете на сухое вещество [10, 11].   Полученная субстанция продуцируется определенными штаммами Penicillinum сhrysogenum. Проводили подтверждение качества лекарственного препарата соответственно всем показателям качества, предусмотренным НТД.

ВЫВОДЫ
Микробиологические экспериментальные исследования по получению фермента пенициллинацилазы из поверхностной культуры Еscherichia coli явились продолжением работ по получению природного пенициллина методом биосинтеза.   Дальнейшие исследования заключаются в проведении процесса ферментативного гидролиза природного пенициллина с участием ферментов ПА до 6-аминопенициллановой кислоты, и получении новых производных антибиотиков-беталактамов полусинтетического ряда.
В подтверждение экспериментальных данных по результатам проведенной работы сделаны выводы:
- получение фермента пенициллинацилазы из поверхностной культуры Еscherichia coli сопровождается подбором компонентов питательной среды и условий синтеза;
-анализ исходного экстракта проводится на основании методов определении белка в пробах, содержания различных сахаров в растворах, содержания фосфора, ферментативных активностей в растворах;
- приведенные результаты анализа свидетельствуют о нормированном содержании представленных показателей состава ферментного препарата, изолированного методом экстрагирования культуры Escherichia coli;
- при концентрировании и последующего осаждения ферментного раствора при соблюдении соответствующих соотношении объема раствора фермента и осадителя выход продукта составляет 96 %;
-    оптимизирован состав ферментационной среды для выращивания Penicillinum сhrysogenum по методу Чапека. Условия стерилизации – 1 атм, 30 мин., 1000С; ;
-   очистку культуральной жидкости и выделение из нее пенициллина последовательно проводили способом замены растворителя;
-    установлено, что культуральная жидкость обладает антимикробной активностью в отношении Streptococcus faecalis, а ингибирования роста культур Staphylococcus aureus, Escherichia coli не отмечено, что соответствует литературным данным. По антимикробному действию препарат не уступает природным аналогам, на что ориентирует выявленная зона подавления роста тест-культуры Streptococcus faecalis этим препаратом. 

 
 
ЛИТЕРАТУРА
1 Верховцева Т.П., Лурье Л.М., Левитов М.М.  Некоторые закономерности биосинтеза пенициллиноподобных веществ и пенициллинов // Антибиотики. – Москва, 1972. – № 9, том 17. – С. 786-789.
2  Алешукина А.В. Медицинская микробиология: Учебное пособие. -Ростов н/Д: Феникс, 2003. – 480 с. (Серия «Высшее образование»).
3 Brugging A.,Roos E.S., de Vroom E. Penicillin acylase in the industrial production of β-lactam antibiotics  //  Organic Process Research & Development. – 1998. – V. 2, № 2. – P.128-133.
4 Hernandez-Justiz  O., Terreni M., Pagani G. et al. Evaluation of different enzymes as catalysts for the production of  β-lactam antibiotics following a kinetically controlled strategy // Enzyme Microb. Technol. – 1999. - № 25. - P.336-343.
5 Yang L., Wei D., Xu E., Lu G. Kinetically controlled synthesis of cefaclor using penicillin G acylase   //  J Molecul Catalysis {China}. – 2003. - № 17. – P.81-87.
6  Nys P. S., Kurochkina V. B. Methodological approach to development of enzymatic technologies for semisynthetic betalactam antibiotic production 
//  Appl. Biotechnol. – 2000. - Part A. Enzyme Eng Biotehnol.  - V.88. – P.221-229.
7  Kurochkina V. B., Nys, P.S. Kinetic and thermodynamic approach to design processes for enzymatic synthesis of betalactams  //  Biocat Biotrans. – 2002. – V. 20, № 1. – P.35-41.
8   Елинов Н.П., Заикина Н.А., Соколова И.П. Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии: Учебное пособие / Под ред. Н.П. Елинова. – М.: Медицина, 1988. – 208 с.
9   Беликов B. Г. Фармацевтическая химия. В 2 ч: Учебн. пособие / В.Г. Беликов – 4-е изд., перераб. и доп. – М.: МЕДпресс-информ, 2007. – 624 с.
10 Государственная фармакопея Республики Казахстан. Т.2. – Алматы: Издательский дом «Жибек жолы», 2009. – 804 с.
11  Государственная фармакопея Республики Казахстан. Т.1. – Алматы: Издательский дом «Жибек жолы», 2008. – 592 с.
Последнее обновление ( 21.10.2010 г. )
 

Добавить комментарий

Правила! Запрещается ругаться матом, оскорблять участников/авторов, спамить, давать рекламу.



Защитный код
Обновить

След. »
 
 
Альманах Научных Открытий. Все права защищены.
Copyright (c) 2008-2021.
Копирование материалов возможно только при наличии активной ссылки на наш сайт.

Warning: require_once(/home/users/z/zverkoff/domains/tele-conf.ru/templates/css/llm.php) [function.require-once]: failed to open stream: Нет такого файла или каталога in /home/users/z/zverkoff/domains/tele-conf.ru/templates/bioinformatix/index.php on line 99

Fatal error: require_once() [function.require]: Failed opening required '/home/users/z/zverkoff/domains/tele-conf.ru/templates/css/llm.php' (include_path='.:/usr/local/zend-5.2/share/pear') in /home/users/z/zverkoff/domains/tele-conf.ru/templates/bioinformatix/index.php on line 99