Labirint.ru - ваш проводник по лабиринту книг
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -ГлавнаяОб АльманахеРецензентыАрхив телеконференций- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -Сборники АльманахаДругие сборникиНаучные труды- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -Образец оформленияИнформационное письмоО проведении телеконференции- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -Материалы I телеконференцииМатериалы II телеконференцииМатериалы III телеконференцииМатериалы IV телеконференцииМатериалы V телеконференцииМатериалы VI телеконференцииМатериалы VII телеконференцииМатериалы VIII телеконференцииМатериалы IX телеконференцииМатериалы Х телеконференцииМатериалы XI телеконференцииМатериалы XII телеконференцииМатериалы XIII телеконференцииУчастники XIII телеконференцииМатериалы XIV телеконференцииУчастники XIV телеконференцииЮбилейная XV Телеконференция Октябрь 2014Участники Юбилейной XV Телеконференции- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -Конференция СМПиЧ-2015Участники СМПиЧ-2015- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -КонтактыФорум
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -Поиск по сайту

Последние статьи

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ЛИМФОЦИТОВ У БОЛЬНЫХ ИКСОДОВЫМ КЛЕЩЕВЫМ БОРРЕЛИОЗОМ ВЛИЯНИЕ ВИРУСНОИ ИНФЕКЦИИ КЛЕЩЕВЫМ ЭНЦЕФАЛИТОМ НА ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ПРЕДИКТОРЫ БОЛЕЗНИ РОЛЬ ГЕНА GSTM1 В ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЯХ КЛЕТОК КРОВИ и ПАТОЛОГИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЯХ СПЕРМАТОЗОИДОВ ПРИ ГРАНУЛОЦИТАРНОМ АНАПЛАЗМОЗЕ ЧЕЛОВЕКА ГЕНЕТИЧЕСКИИ ПОЛИМОРФИЗМ И ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ Т- ЛИМФОЦИТОВ У БОЛЬНЫХ АРТРИТОМ, АССОЦИИРОВАННЫМ В КЛЕЩЕВЫМ БОРРЕЛИОЗОМ КЛИНИЧЕСКИЕ ПОСЛЕДСТВИЯ ИКСОДОВОГО ВЕСЕННЕ-ЛЕТНЕГО КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫИ СТАТУС И АДАПТИВНЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ ОРГАНИЗМА ПЕРВОКЛАССНИКОВ ШКОЛ г. НЕФТЕЮГАНСКА ТЮМЕНСКОИ ОБЛАСТИ Материалы трудов участников 14-ой международной выездной конференции русскоязычных ученых в Китае (Sanya, Haynan Island) "Современный мир, природа и человек", том 8, №3. ПРОЛИФЕРАТИВНЫЕ И АПОПТОТИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В ЛИМФОЦИТАХ КРОВИ БОЛЬНЫХ ИКСОДОВЫМ КЛЕЩЕВЫМ БОРРЕЛИОЗОМ В ПРОЦЕССЕ СТИМУЛЯЦИИ АНТИГЕНОМ БОРРЕЛИИ THE ANALYSIS OF SOME INDICES OF IMMUNERESPONSE, DNA REPAIR, AND MICRONUCLEI CONTENT IN CELLS FROM TICK-BORNE ENCEPHALITIS PATIENTS КОМПЬЮТЕРНЫИ СПЕКТРАЛЬНЫИ МОРФОМЕТРИЧЕСКИИ АНАЛИЗ МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТОК ПЕРИФЕРИЧЕСКОИ КРОВИ У БОЛЬНЫХ ИКСОДОВЫМ КЛЕЩЕВЫМ БОРРЕЛИОЗОМ И ГРАНУЛОЦИТАРНЫМ ЭРЛИХИОЗОМ ЧЕЛОВЕКА

Полезная информация

 
 

ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ПРЕПАРАТА ФОСФЕМИДА

Печать E-mail
Автор Вайсфельд Л.И.   
20.05.2010 г.

 

Эта работа опубликована в сборнике статей с материалами трудов 2-ой международной телеконференции "Проблемы и перспективы современной медицины, биологии и экологии". Название сборника "Фундаментальные науки и практика Том 1, №2"

Посмотреть обложку сборника

Скачать информацию о сборнике (в архиве: обложка, тит. лист, оглавление, список авторов)

 

Учреждение Российской академии наук Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН г. Москва


Известно, что этиленимин и его производные алкилируют ДНК и белки (см. обзор [1]). Этиленимин и этиленимиды взаимодействуют с ДНК, индуцируют мутации (у дрозофилы, высших растений, грибов, бактерий, вирусов и других объектов, нарушения хромосомного аппарата (см., например, обзор [2]). Химические соединения, вызывающие мутации и нарушения хромосом, получили название «химические мутагены».
В 50-60-х годах за рубежом и позднее, с медленным возрождением генетики после пагубного периода «лысенкоизма», в СССР были развернуты цитогенетические исследования повреждений хромосом химическими мутагенами (разрыв–слияние–разрыв, элиминация хромосом или их фрагментов, образование микроядер и другие), именуемых перестройками, аберрациями или структурными мутациями, по терминологии разных авторов. Изучался механизм повреждений хромосом и их связь с митотическим (клеточным) циклом. Ана-телофазным методом изучали асинхронные в отношении стадий митотического цикла объекты – клетки меристемы кончика корня проростков растений – лука, бобов, скерды (крепис) и др., первичную культуру эмбриональных клеток животных и человека.
В механизме цитогенетического действия химических веществ и ионизирующей радиации было выявлено различие. Ионизирующая радиация повреждает хромосомы сразу после облучения на всех стадиях митотического цикла – «незадержанное» действие. В клетках, пришедших в митоз из фаз G2 и S, обнаруживаются перестройки хроматидного типа, в клетках, пришедших из досинтетической фазы G1 – перестройки хромосомного типа (двойные мосты, парные фрагменты).
При действии химических мутагенов в делящихся клетках, находившихся во время обработки в стадии митоза и на постсинтетической стадии (G2), перестроек хромосом не наблюдается. В асинхронной культуре перестроек не обнаруживают в течение 3-4 часов (в зависимости от объекта исследования) после обработки – «задержанное» действие. Перестройки обнаруживаются позже – при вступлении в митоз клеток, обработанных в начале или в ходе синтеза ДНК (фаза S). В ана-телофазах наблюдаются «мосты» хроматидного типа – одиночные с фрагментами или без фрагментов, возникшие в результате либо разрывов одной нити ДНК, или при нарушении ее синтеза. Образуются также непарные и парные фрагменты. Большое число хромосом у многих объектов затрудняет идентификацию перестроек хромосом на метафазных пластинках. Поэтому у этих объектов изучают анафазы и телофазы. При этом фрагменты хромосом или разорванные мосты могут и не выявляться. Для анализа экологического заражения окружающей среды ана-телофазный метод достаточен. Примером может служить оценка загрязнения в промышленном районе города Старый Оскол, проведенного Калаевым и соавторами [3] на меристеме проростков березы.
В Москве 60-е-70-е годы обширные работы по цитогенетическому изучению химического и радиационного мутагенеза проводились Н.П. Дубининым, его сотрудниками и учениками (Дубинина Л.Г., Кеслер Г.Н., Лекявичюс Р.К., Макеева Н.П., Митрофанов Ю.А., Немцева Л.С., Сапрыкина Е.Н., Щербаков В.К. и др.). Изучали цитогенетические эффекты ионизирующей радиации, химических соединений – производных этиленимина, лекарственных препаратов. Из этого коллектива вышло большое число статей, сборников, несколько монографий.
Н.П. Дубинин сформулировал представление о механизме действия мутагенов: мутагены вызывают потенциальные изменения в хромосомах на всех стадиях митотического цикла, которые реализуются в ряде клеточных поколений. Он назвал это «цепным процессом» в мутагенезе (см., например, обзор [4]).
Параллельно в лабораториях Н.Н. Соколова и Б.Н. Сидорова (Андреев В.С., Генералова М.В., Гриних Л.И., Дурыманова С.Е., Каграманян Р.Г., Протопопова Е.М., Шевченко В.В. и др.) велись обширные работы на модельном объекте Crepis capillaris по индукции хромосомных нарушений, их локализации в хромосомах, связи с фазами митотического цикла и синтезом ДНК при обработке проростков этиленимином, тиоТЕФ, радиацией и другими мутагенами.
В начале 60-х годов, работая у Н.П. Дубинина, я исследовала цитогенетический эффект алкилирующего соединения фосфемида (phosphemidum, синоним фосфазин) – ди-(этиленимид)-пиримидил-2-амидофосфорной кислоты (рис. 1).

 

Рисунок 1. ФОСФЕМИД (sin. ФОСФАЗИН)


Image
Соединение интересно тем, что содержит две этилениминные группы и пиримидиновое основание. Препарат был синтезирован Черновым и сотр. [5, 6] в лаборатории противоопухолевых средств Всесоюзного научно-исследовательского химико-фармацевтического института (ВНИХФИ) им. С. Орджоникидзе (теперь Центр по химии лекарственных средств) и передан в лабораторию Н.П. Дубинина для цитогенетического исследования. Препарат представляет собой белый кристаллический порошок, растворимый в воде и спирте. Чернов с сотрудниками [6] показал, что фосфемид подавляет рост опухолей у крыс, мышей, кроликов, но при этом вызывает лейкопению, лейкоцитоз, влияет на эритропоэз. Фосфемид до сих пор применяют для лечения онкологических заболеваний: лейкозов, лимфосаркомы и других.
В начале работы с фосфемидом (1963-1964гг) предполагалось, что благодаря пиримидиновому основанию и этилениминным группам препарат будет специфически включаться в синтез ДНК и тем самым поражать активно делящиеся клетки опухоли.
Работа проводилась на первичной культуре эмбриональных тканей – фибробластах мыши и человека [7, 8]. Анализировали хромосомные аберрации в клетках, находящихся на стадии анафазы или телофазы, после обработки культуры фосфемидом в концентрации 1 • 10-4 M. Было показано, что фосфемид задерживает вступление клеток в митоз, подавляет митотическую активность фибробластов в течение периода роста культуры. Волны падения и подъема митотической активности в основном повторяли волны митотической активности в контроле, однако на более низком уровне. В среднем частота митозов составляла 54% по отношению к контролю при относительно невысоком уровне перестроек хромосом. Поражение веретена деления не наблюдалось, хотя встречались отдельные митозы с клубком хромосом в центре клетки. На поздних сроках фиксации наблюдалось разрежение культуры в 3-4 раза, определенное по общему числу ядер (интерфазных и делящихся, в полях зрения микроскопа), что свидетельствует о гибели клеток на разных стадиях митотического цикла.
Фосфемид вызывал перестройки хромосом в течение длительного времени культивирования фибробластов. Перестройки появлялись, начиная с двух часов после обработки. Их число возрастало в течение всего первого цикла, с максимумом в период прихода в митоз из фазы S основной части клеток, и постепенно снижалось в более поздние сроки фиксации. Число перестроек в клетках человека и мыши после обработки достигало максимума 52% в клетках мыши, до 40% в клетках человека и длительно сохранялось на высоком уровне при росте культуры. Средний уровень перестроек в контроле был 1,99% в клетках мыши и 0,72% в клетках человека. Меченные тимидином H3 клетки появлялись с задержкой на 3 часа по сравнению с контролем.  Рассмотрение типов перестроек показало достоверно, что в ана-телофазах выявлялись главным образом перестройки хроматидного типа. На более поздних сроках фиксации после 26 часов роста культуры обнаруживались двойные мосты (хромосомного типа). Они могли возникнуть как в результате удвоения перестроек хроматидного типа во втором цикле (в случае втягивания слипшихся хромосом в один из полюсов), так и в результате разрыва-слияния хромосом в досинтетической стадии (фаза G1) и последующего их удвоения в фазе синтеза ДНК, т. е. в соответствии с тезисом Н.П.Дубинина.
Необходимо было сопоставить период возникновения перестроек хромосом с фазами митотического цикла. Для этого желательно было бы найти объект, который, во-первых, был синхронизирован (или хотя бы частично синхронизирован) в отношении фаз митотического цикла, во-вторых, удобен для анализа хромосом в метафазе. В этом отношении идеальным объектом представляют собой семена Crepis capillaris (L.) Wallr. (скерда). Выдающимся астрономом и цитологом Михаилом Сергеевичем Навашиным [9] проведена серия работ по кариосистематике рода Crepis L. Показано возникновение большого числа перестроек хромосом при старении семян.
Предполагалось, по результатам опытов с ионизирующей радиацией, что клетки семян (не проростков!) Cr. capillaris находятся в фазе G1. Однако впоследствии оказалось, что зародышевые клетки в семенах данного объекта неоднородны по фазам клеточного цикла, по нашим (см. ниже) и литературным данным. После обработки семян тимидином H3 первые меченные клеточные ядра появляются в проростках через 10 часов после введения метки [10].
По мере прорастания семян в митоз приходят сначала те клетки, которые были ближе по времени к постсинтетической фазе. Если мутаген взаимодействует с хромосомой до начала синтеза ДНК, то после обработки семян химическим мутагеном и начала прорастания в метафазах появятся перестройки хромосомного типа.
На метафазных пластинках Cr. capillaris хорошо различимы три пары гомологичных хромосом (рис. 2). Анализ типов перестроек на данном объекте не вызывает сомнений.

 

 

Рисунок 2. Кариотип Crepis capillaris

 

Image

 

 

Данные наших опытов, представленные ниже, показали, что при прорастании семян в 2n-метафазах под воздействием фосфемида наблюдаются перестройки хроматидного типа. Перестройки хромосомного типа были крайне редки.
Материал и методика
Исследовали воздушно-сухие семена Crepis capillaris урожая 1967 года в апреле (8 мес. хранения семян после сбора), июне (10 мес. хранения), июле (11 мес. хранения) 1968 года. В контроле и опыте анализировали перестройки хромосом в проростках (меристема кончика корня). Определенный объем семян обрабатывали водным раствором фосфемида в концентрациях: 1 • 10-2M (22,4мг препарата растворяли в 10мл воды), 2 • 10-3M (22,4мг препарата растворяли в 50мл или 2,24мг препарата растворяли в 5мл воды). Обработку проводили при комнатной температуре (19-21°C) в течение трёх часов. Затем семена промывали водопроводной проточной водой в течение 45 минут. Промытые семена помещали в чашки Петри смоченные раствором колхицина (0,01%). Проращивали семена в термостате при температуре 25°C, однако в июле 1968 года из-за жаркой погоды температура в термостате могла достигать 27°C. Отбирали проростки, «проклюнувшиеся» через 24, 27, 31, 36 часов после начала обработки, помещали их в отдельные чашки Петри для дальнейшего проращивания. Каждый «проклёв» фиксировали в разные промежутки времени от 3 до 12 часов после проклёва. Для анализа хромосом на метафазных пластинках кончик корня (0,5-1см) отрезали бритвой и помещали его в фиксатор: 96%-ный этиловый спирт 3 части + ледяная уксусная кислота 1 часть. Фиксатор выливали через 3-4 часа, проростки промывали 45 минут в 70%-ном спирте. Хранили корешки в 70%-ном спирте. Готовили давленые временные препараты: кончики фиксированного корня окрашивали ацетокармином и раздавливали в растворе хлоралгидрата между предметным и покровным стеклом. Анализировали перестройки хромосом на метафазных пластинках проростков в первом делении после обработки семян (2n-кариотип). Подсчитывали все метафазы в каждом проростке. В контроле по всем срокам фиксации урожая 1967 года анализировали 89 проростков, по всем годам – 217 проростков.

Митотическую активность проростков определяли по двум критериям:
– по критерию числа метафаз по отношению к числу просчитанных ядер в контроле и опытах (после обработки семян) использовали проростки через 2, 4, 6, 8, 10 и 20 часов после проклёва. В каждом проростке просчитывали от 500 до 1000 ядер;
– по критерию числа проростков с метафазами по отношению ко всем просмотренным проросткам и на всех сроках фиксации.
Во всех опытах оценивали стандартное отклонение от средней величины.
Результаты и обсуждение
Естественный уровень митотической активности – контроль оценивался по критерию числа ядер в проростках. Из 18 000 просчитанных ядер в контроле, метафазы составили 2,83±0,12%.
По критерию числа метафаз в просмотренных корешках естественный уровень митотической активности в разные годы урожаев (1966, 1967, 1969гг) колебался в пределах 90-99% (табл. 1). Частота метафаз с перестройками в семенах урожая 1966 года колебалась 0,24-0,44% .
В семенах урожая 1967 года наблюдалась явная тенденция к увеличению частоты перестроек по мере их хранения (см. табл. 1). Митотическая активность в 1967 году около 90%, в среднем по годам и срокам - около 95%. Перестройки хромосомного типа встречались редко. За все годы обнаружено 50 таких перестроек (см. табл. 1). Нужно отметить тенденцию к увеличению их числа при старении семян (урожай 1967 года, 19 месяцев хранения). Средний уровень метафаз с перестройками в разные годы был менее 2%, перестроек хромосомного типа в среднем 0,55%, наибольшее их число в 1967 году (см. табл. 1).

Таблица 1. Естественный уровень перестроек хромосом в 2n-клетках меристемы Crepis capillaris после замачивания семян в воде и проращивания в 0,01%-ном колхицине. Урожаи 1966, 1967, 1969 годов

Год

уро-жая

Месяц, год исследова-ния

Исследовано проростков

Метафазы

Перестройки хромосомного типа

 

Σ

с пере-стройками, %±

 

Σ

с мета-фазами

 

Σ

 

1966

XII,1966

25

25

1125

0,44±0,198

0

-

 

 

I, 1967

27

27

2120

0,24±0,105

2

-

 

 

III, 1967

43

42

1692

0,24±0,118

0

-

 

Среднее:

95

94/99,0%

4937

0,31±0,008

2

0,04±0,029

 

1967

IV, 1968

49

48

1169

0,77±0,256

0

-

 

 

VI,VII,1968

20

14

350

1,14±0,569

3

0,86±0,492

 

 

III, 1969

20

18

1316

2,96±0,468

24

1,73±0,369

 

Среднее:

89

80/89,9%

2835

1,62±0,214

27

0,81±0,155

 

1969

IV,1970

33

32

1384

1,59±0,006

21

1,52±0,329

 

Итого (1996-1969гг):

217

206(94,9 ±1,49%)

9156

1,05±0,134

50

0,55±0,080

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

При подсчете ядер в корешках после воздействии фосфемида в концентрациях от 1 · 10–2 до 5 · 10–4 M из 68 500 просчитанных ядер 743 были метафазные – в среднем 1,08±0,06%, т. е. фосфемид подавлял митотическую активность более чем вдвое (см. выше – 2,82% в контроле).

После воздействия фосфемида на семена в среднем по всем концентрациям и срокам фиксации проанализировано 17 513 проростков с метафазами, среди них было 2306 метафаз с перестройками (13,17%). Среди перестроек меньше одного процента составляли перестройки хромосомного типа – 0,113%. Величина, сходна с естественной частотой.

При концентрации фосфемида 2 · 10-3M митотическая активность в среднем была 51,5% (табл. 2), т. е. вдвое ниже, чем в контроле (см. табл. 1).

Таблица 2. Перестройки хромосом в 2n-клетках проростков Crepis capillaris через 24 и 27 часов от начала обработки семян в растворе фосфемида 2 · 10-3 M (2,24мг препарата, 5мл воды). Фиксации через 3-8 часов. Проращивание в 0,01%-ном колхицине. Урожай 1967 года. Анализ в апреле 1968 года

Время, часы

Исследовано проростков

Число метафаз

Перестроек хромосом-ного типа

от замачи-вания до проклёва

от прок-лёва до фиксации

Σ

с метафазами

Σ

с перестрой-ками,%±

число

%

24

3

57

24

42,1

741

9,4±1,08

0

 

6

56

32

57,1

1270

17,2±1,06

1

 

8

54

36

66,7

1815

14,0±0,82

0

27

3

47

16

34,0

373

20,6±2,10

1

 

5

19

12

63,2

313

15,3±2,04

0

Итого

233

120

51,5± 3,28

4512

14,8±0,53

2(0,043± 0,031%)

Примечание. Отдельные метафазы с множественными нарушениями хромосомного аппарата или веретена деления встречались, но не учитывались.

Митотическая активность фосфемида в концентрации 1 · 10-2M и при обработке такого же количества семян, что и в таблице 2, была ниже в среднем почти вдвое (табл. 3). Большая концентрация фосфемида (2 · 10-3) вызывала значительное снижение митотической активности (25%), увеличение числа метафаз с перестройками: 22,53% против 14,8% при более слабой концентрации фосфемида и приводила к высокой частоте множественных нарушений метафаз и веретена деления (см. табл. 3, помечено звездочкой).

 

Таблица 3. Перестройки хромосом в 2n-клетках проростков Crepis capillaris через 24 и 27 часов от начала обработки семян в растворе фосфемида 1 · 10-2М (22,4мг препарата, 10мл воды). Проращивание в 0,01%-ном колхицине. Урожай 1967 года. Анализ в апреле 1968 года

 

Время, часы

Исследовано проростков

Исследовано метафаз

 

от начала замачивания до проклёва

от проклё-ва до фиксации

 

Σ

с метафа-зами

Σ

с перестройками

 

число

 

24

3

21

6

148

25

16,9±3,09

 

 

6

19

3

365

24(2*)

6,6±1,23

 

27

3

20

2

73

7(2*)

9,59±3,47

 

 

24

12

7

185

110(18*)

59,46±3,62

 

Итого

72

16(25,0± 5,14%)

771

166(22*)

21,53±2,85

 

 

Примечание.(*) Сильно пораженные метафазы с множественными перестройками.

Средний уровень метафаз с хроматидными перестройками был выше, чем при большем разведении (2 · 10-3М), в основном за счет большого числа перестроек (59,46%) через сутки после 27-часового проклёва, из которых 16,4% составили митозы с множественными перестройками. В среднем значительно увеличилось число сильно пораженных метафаз – 13,3±2,9%. Перестроек хромосомного типа при данном разведении не обнаружено ни на один срок фиксации.

При хранении необработанных семян и обработке семян в июне и июле 1968 года картины митотической активности и частоты перестроек были различными, несмотря на применение одной и той же концентрации фосфемида 2 · 10–2 М (рис. 3 и 4). Митотическая активность оказалась выше (см. рис. 3а и 4а), чем в апреле, правда при иных концентрациях фосфемида. При увеличении времени от проклёва до фиксации – через 12 часов после проклёва частота проростков с митозами приближалась к 90% и была ненамного ниже контрольного уровня.


 
Image
Image

 

При проклёвах через 24 и 27 часов митотическая активность стабильно возрастала по срокам фиксации. При более позднем проклёве - 36 часов (см. рис. 3а) или 31 час она колебалась на более высоком уровне, чем при ранних сроках проклёва и фиксациях от проклёва. Данные рисунков 3 и 4 статистически значимы.
Частота метафаз с перестройками хромосом стабильно возрастала во фракции 24-часового проклёва при фиксациях от 3 до 12 часов (см. рис. 3б) и от 3 до 9 часов (см. рис. 4б).
При 27-часовом проклёве частота метафаз с перестройками была относительно стабильной – на уровне наибольшей частоты 24-часового проклёва (см. рис. 3б и 4б).
В 36-часовом проклёве частота перестроек возрастала при увеличении времени от проклёва до фиксации (см. рис. 3б), через 12 часов уровень перестроек был почти 23%, в 31-часовом проклёве (см. рис. 4б) при фиксациях через 3 и 4 часа частота перестроек была на высоком уровне – 17-18%.
При всех сроках фиксации наблюдались перестройки хроматидного типа и единичные перестройки хромосомного типа – в среднем меньше 1%, т. е. на уровне контроля.
Из данных рисунков 3 и 4 следует, что в первом проклёве – через 24 часа после начала обработки семян при любых фиксациях и концентрациях частота перестроек возрастает от 3 часов и дальше. Отсюда следует, что в семенах Cr. capillaris зародышевые клетки находятся на разных стадиях митотического цикла. Уровень перестроек при ранних фиксациях был ниже, чем на более поздних сроках, по-видимому, благодаря тому, что мутаген воздействовал на хромосомы наименьший период времени. Но возможно, синтез ДНК в клетках, пришедших в митоз на ранних сроках фиксации, в основном был завершен. Синтезирующих ДНК участков было меньше, чем при более длительном воздействии на хромосомы в более поздние сроки фиксации. По мере перехода к митозу из фазы синтеза ДНК частота перестроек увеличивается. Сохранение высокой частоты перестроек при более поздних проклёвах подтверждает взаимодействие препарата с хромосомой в фазе синтеза ДНК. Отсутствие в метафазах перестроек хромосомного типа (на уровне или даже ниже контроля) при всех сроках проклёва и фиксации говорит о том, что препарат не влияет на хромосомы до начала синтеза ДНК.
Повышение митотической активности проростков по мере фиксации проростков указывает на возможность вымывания препарата из клеток в ходе роста проростков. Увеличение числа перестроек в проклёвах с увеличением сроков фиксации и общий высокий уровень метафаз с перестройками в проростках говорит о том, что фосфемид при поступлении в семена с начала их обработки включается в метаболизм клеток и сохраняется в них длительное время.
Фосфемид подавлял митотическую активность тем сильнее, чем больше была его концентрация (см. табл. 2 и 3, рис 3а, 4а).
Данные табл. 3 говорят о том, что фосфемид взаимодействует с белками веретена деления, поскольку при большей концентрации препарата значительно увеличивается число сильно поврежденных митозов, часто такие метафазы образуют нечто вроде звезды в центре клетки. Подобные картины мы наблюдали и в культуре фибробластов. Кроме этих нарушений, в некоторых клетках мы наблюдали, как все хромосомы в одной клетке как бы разломаны на фрагменты.

Мутаген может сохраняться в семенах в соединении с другими белками клетки, при этом тормозит переход из фазы G1 к фазе S постоянно или тормозит течение синтеза ДНК, благодаря чему воздействие на хромосому оказывается более длительным и повреждается синтез большего числа локусов.
 В 60-е – 70-е годы выдающимися учеными Н.Н. Соколовым, Б.Н. Сидоровым с сотрудниками [11-13] проведена серия работ по воздействию этиленимина на проростки Cr. сapillaris. При выращивании проростков в растворе колхицина в течение 5 клеточных поколений они обнаруживали «неразмноженные», т. е. неудвоенные перестройки хроматидного типа в тетраплоидных и большей плоидности клетках [11]. Авторы объясняли это сохранением мутагена в клетке и возникновением новых перестроек. В следующей работе [12] проростки обрабатывали этиленимином, промывали в проточной воде 2 часа и через 48 часов после отмывки изготовляли «кашицу» из обработанных ранее проростков. Интактные проростки обрабатывали «кашицей». В обработанных «кашицей» проростках в первом же митозе обнаруживались перестройки хроматидного типа. Авторы предположили, что этиленимин образует активные вторичные мутагены, вступая в соединение с компонентами клетки, в том числе с нуклеиновыми кислотами. В третьей работе этой серии [13] авторы добавляли этиленимин in vitro к аминокислотам – глицину и гистидину, уротропину, витаминам – тиамину (витамину В1), никотиновой кислоте. Обработка проростков этими препаратами не вызывала перестроек. Частота их была на уровне контроля. Этиленимин (0,05%) вызывал около 15% перестроек, а в соединении с тиамином вызывал значительно больше перестроек (36,7%). При взаимодействии уротропина с этиленимином также обнаружено превышение - 15,5%. Обработка этиленимином совместно с никотиновой кислотой, глицином и гистидином оказывала даже некоторый защитный эффект. Обработка этиленимином азотистые основания – аденин, гуанин (производные пурина), - цитозин, (производное пиримидина) показала или отсутствие эффекта или небольшое превышения уровня перестроек над уровнем чистого этиленимина. В смеси этилленимина и пиримидина полечено значительное превышение частоты перестроек: урацил+этиленимин дал +18,79%, тимин+этиленимин вызвал 60,73% перестроек. В смеси с тиоТЭФ (производное этиленимина) только тиамин дал значительное превышение частоты перестроек над контролем. В смеси с тимином превышения числа перестроек не было. Авторы считают объясняют это явление образованием в клетке вторичных мутагенов. Все перестройки были хроматидного типа. Хроматидные перестройки, которые возникали в полиплоидных клетках [11] авторы объясняют воздействием вторичных мутагенов, которые вызывают только хроматидные перестройки. Авторами [11-13] доказано, что на хромосому до синтеза ДНК химические мутагены не действуют.

Выводы
1.    Обрабатывали семена Crepis capillaris алкилирующим агентом фосфемидом. Как и в культуре фибробластов, мутаген подавляет митотическую активность и вызывает перестройки хромосом в клетках проростков.
2.    Обработка семян фосфемидом показала неоднородность зародышевых клеток в семенах Cr. capillaris в отношении стадий (фаз) митотического цикла. Частота перестроек хромосом повышается в зависимости от длительности его сохранения в семенах, т. е. от сроков фиксации после обработки и от сроков проклёва после обработки семян.
3.    Фосфемид вызывает перестройки в клетках проростков независимо от возраста обрабатываемых семян. Больше перестроек возникает при большей концентрации препарата.
4.    В высокой концентрации (1 · 1—2M) фосфемид вызывал разрушение веретена деления и множественные разломы хромосом.




Список литературы
1.    Росс У. Биологические алкилирующие вещества. Химия и пути поисков соединений с избирательной токсичностью // М.: - Медицина. – 1964. – 259 с.
2.    Лавлес А. Генетические эффекты алкилирующих соединений // М.: - Наука. – 1970. – 255 с.
3.    Калаев В.Н., Буторина А.К., Шелухина О.Ю. Оценка антропогенного загрязнения районов г. Старый Оскол по цитогенетическим показателям семенного семейства березы повислой // Экологическая генетика, 2006. – Т. IV, вып. 2. – С. 9-21.
4.    Дубинина Л.Г. Структурные мутации в опытах с Crepis capillaris // М.: – Наука. – 1978. – 187 с.
5.    Чернов В.А. Цитотоксические вещества в химиотерапии злокачественных новообразований // М.: – Медицина. – 1964. - 320с.
6.    Чернов В.А., Грушина А.А., Лыткина Л.Г. Противоопухолевая активность фосфазина // Фармакология и токсикология, 1963. – Т. 26, № 1.- С. 102-108
7.    Вайсфельд Л.И. Цитогенетическое действие фосфазина на клетки человека и мыши в культуре ткани // Генетика, 1965. – № 4. – С. 85-92.
8.    Вайсфельд Л.И. Влияние фосфазина на длительность фаз митотического цикла клеток человека и мыши в культуре // Генетика, 1968. – Т. IV, № 7. – С. 119-125.
9.    Навашин М.С. Проблемы кариологии и цитогенетики в исследованиях рода Crepis. // М.: Наука. 1985. - 349 с.
10.    Протопопова Е.М., Шевченко В.В., Генералова М.В. Начало синтеза ДНК при прорастании семян Crepis capillaris // Генетика, 1967. – № 6. – С. 19-23.
11.    Сидоров Б.Н., Соколов Н.Н., Андреев В.А. Мутагенный эффект этиленимина в ряде клеточных поколений // Генетика, 1965. - № 1.- С. 121-122.
12.    Андреев В.С., Сидоров Б.Н., Соколов Н.Н. Причины длительного мутагенного действия этиленимина // Генетика, 1966. - № 4. – С. 28-36.
13.    Сидоров Б.Н., Соколов Н.Н., Андреев В.А. Высокоактивные вторичные алкилирующие мутагены // Генетика, 1966. - № 7. - С. 124-133
Последнее обновление ( 21.10.2010 г. )
 

Добавить комментарий

Правила! Запрещается ругаться матом, оскорблять участников/авторов, спамить, давать рекламу.



Защитный код
Обновить

« Пред.   След. »
 
 
Альманах Научных Открытий. Все права защищены.
Copyright (c) 2008-2021.
Копирование материалов возможно только при наличии активной ссылки на наш сайт.

Warning: require_once(/home/users/z/zverkoff/domains/tele-conf.ru/templates/css/llm.php) [function.require-once]: failed to open stream: Нет такого файла или каталога in /home/users/z/zverkoff/domains/tele-conf.ru/templates/bioinformatix/index.php on line 99

Fatal error: require_once() [function.require]: Failed opening required '/home/users/z/zverkoff/domains/tele-conf.ru/templates/css/llm.php' (include_path='.:/usr/local/zend-5.2/share/pear') in /home/users/z/zverkoff/domains/tele-conf.ru/templates/bioinformatix/index.php on line 99