Национальный университет пищевых технологий (г. Киев, Украина)

 

Эта работа опубликована в сборнике научных трудов «Современный мир, природа и человек», Т.2, №1, с материалами Пятой, Юбилейной Телеконференции, посвященной 120-летию открытия описторхоза у человека профессором медицинского факультета Томского университета К.Н. Виноградовым (6-11 июня 2011 года, г. Томск).

Скачать сборник целиком

Скачать информацию о сборнике (титульный лист, обложку, оглавление, список авторов)

 

В последнее время наблюдается усиление резистентности многих патогенных микроорганизмов к существующим лекарственным средствам, что обусловило поиск альтернативных препаратов. Такими потенциальными для использования в медицине могут быть микробные поверхностно-активные вещества (ПАВ), поскольку они нетоксичны, не вызывают аллергии и проявляют антимикробное действие в отношении широкого спектра микроорганизмов, а также способны усиливать антмикробное действие других препаратов [P. Das, S. Mukherjee, R. Sen, 2008; L. Rodrigues, I.M. Banat, J. Teixeira, R. Oliveira, 2006; B. Mimee, C. Labbe, R. Pelletier,  R. R. Belanger, 2005]. Кроме того они могут предотвращать формирование биопленок на поверхностях различных материалов [M. Nitschke, L.V. Araujo, S.G.V.A.O. Costa, R.C. Pires at al., 2009; F. Rivardo, R.J. Turner, G. Allegrone at al., 2009], которые используются в медицине (например, катетеров, протезов).
Цель данной работы – исследование антимикробных свойств и антиадгезивной активности поверхностно-активных веществ Rhodococcus erythropolis ЭК-1 и Acinetobacter calcoaceticus K-4, а также их влияния на антимикробное дествие эфирного масла чайного дерева. Штаммы R. erythropolis ЭК-1 и A. calcoaceticus K-4 изолированы из загрязненных нефтью образцов почвы [Т.П. Пирог, Т.А. Шевчук, И.Н. Волошина, Н.Н. Грегирчак, 2005] и депонированы в Депозитарии микроорганизмов Института микробиологии и вирусологии НАН Украины под номерами ИМВ Ас-5017 и ИМВ В-7241.
Культивирование штаммов проводили в установленных раньше оптимальных условиях на модифицированных нами жидких питательных средах [Т.П. Пирог, С.И. Антонюк, Е.В. Карпенко, Т.А. Шевчук, 2009; Т.П. Пирог, Т.А. Шевчук, И.Н. Волошина, Е.И. Карпенко, 2004]. В качестве препаратов ПАВ использовали стерильный супернатант культуральной жидкости.
Для получения супернатанта нативную культуральную жидкость центрифугировали в течение 45 мин (5000g) для осаждения биомассы, надосадочную жидкость сливали и автоклавировали при 112°С (30 мин). Такую термообработку осуществляли для уничтожения клеток продуцента. Количество ПАВ в культуральной жидкости (г/л) определяли весовым методом после экстракции поверхностно-активных веществ смесью Фолча [Т.П. Пирог, С.И. Антонюк, Е.В. Карпенко, Т.А. Шевчук, 2009].
В опытах с эфирным маслом чайного дерева приготовление препаратов проводили согласно рекомендациям, изложенным в инструкции по ее использованию. Как эмульгатор использовали раствор пищевой соды (как указано в инструкции по использованию масла чайного дерева), а также препараты ПАВ R. erythropolis ЭК-1:
1) препарат 1 (0,25 мл масла чайного дерева + 4 мл раствора ПАВ). Смесь выдерживали 1 ч на качалке (320 об/мин) для получения эмульсии;
2) препарат 2 (0,25 мл масла чайного дерева + 4 мл раствора пищевой соды). Способ приготовления аналогичный препарату 1. Концентрация стерильного раствора гидрокарбоната натрия аналогична концентрации раствора ПАВ;
3) препарат 3 (0,25 мл масла чайного дерева + 4 мл дистиллированной воды). Этот контрольный препарат использовали для оценки антимикробного действия масла;
4) препарат 4 (0,25 мл дистиллированной воды + 4 мл раствора ПАВ). Использование такого контрольного препарата дает возможность оценить антимикробное действие препаратов ПАВ.
В работе использовали следующие тест-культуры: Escherichia coli ИЭМ-1, Bacillus subtilis БТ-2, Staphylococcus aureus БМС-1, Candida albicans Д-6, Candida tropicalis ПБТ-5, Candida utilis БВС-65, Saccharomyces cerevisiae ОБ-3, Aspergillus niger Р-3, Fusarium culmorum Т-7. Чистые культуры бактерий, грибов и дрожжей сохраняются в музее живых культур микроорганизмов кафедры  биотехнологии и микробиологии Национального университета пищевых технологий.
Антимикробные свойства препаратов исследовали так. В исходную суспензию суточных (24 ч) тест-культур, выращенных на агаризированных средах (бактерии на МПА при 30–37 °С, грибы при 26 °С и дрожжи при 30 °С на ГКА), определяли количество живых клеток по методу Коха (колоний-образующих единиц, КОЕ/мл). потом суспензию тест-культур вносили в пробирки (3 мл), добавляли 1,5–3 мл препарата ПАВ и выдерживали в течении 1 и 2 ч при температуре, оптимальной для роста тест-культур. После экспозиции по методу Коха определяли количество живых клеток (с учетом изменения объема суспензии в результате внесения препаратов ПАВ).
Выживание клеток определяли как отношение количества живых клеток в обработанных препаратами ПАВ образцах к количеству клеток в исходной суспензии и выражали в процентах.
В опытах с эфирным маслом чайного дерева в суспензию тест-культур (3 мл) вносили по 640 мкл препаратов 1–4 и определяли по методу Коха количество живых клеток сразу после внесения препаратов и через 15 мин. Такая продолжительность обработки была выбрана согласно рекомендаций как оптимальная для прополаскивания ротовой полости препаратом эфирного масла чайного дерева.
Для определения антиадгезивных свойств препаратов ПАВ одинаковые пластинки исследуемого материала (1 см2) (линолеум, кафель, пластик, нержавеющая сталь) очищали и стерилизовали в соответствии с материалом (кафель, нержавеющая сталь – при 112 °С, 1 ч; пластик, линолеум – 112 °С, 30 мин). Одну часть пластинок помещали на 24 ч в супернатант ПАВ, а другую – в стерильную дистиллированную воду и выдерживали при комнатной температуре. Затем пластинки ополаскивали 10 мл стерильной дистиллированной водой, чтобы смыть остатки препаратов.
В суспензию тест-культур помещали ранее обработанные и контрольные образцы и выдерживали 2 ч при комнатной температуре, которые затем ополаскивали 10 мл стерильной водопроводной воды, чтобы смыть неадгезированные клетки. Пластинки помещали в колбу с 20 мл стерильной водопроводной воды и шариками бисера, трясли 5 мин, чтобы смыть адгезированные клетки, количество которых определяли при помощи метода Коха.
Количество адгезированных клеток определяли как соотношение числа адгезированных клеток на заранее обработанных образцах к числу клеток на контрольных образцах и выражали в процентах.
Проявление антимикробных свойств различных соединений зависит от ряда факторов: концентрации клеток, концентрации исследуемого вещества и продолжительности экспозиции. Наши эксперименты показали, что исследованные препараты ПАВ были эффективными против бактериальных тест-культур. Исследование зависимости выживания клеток B. subtilis БТ-2 от концентрации ПАВ R. erythropolis ЭК-1 и продолжительности обработки  показало, что при концентрации ПАВ в препарате 0,98 мг/мл наблюдалась гибель более 90 % клеток уже через час экспозиции. При более низкой концентрации ПАВ (0,61 мг/мл) выживание клеток составляло 53–55 % независимо от длительности обработки. Более сильное антимикробное действие оказывали препараты ПАВ A. calcoaceticus K-4 (0,22 мг/мл), которые вызывали 100 % гибель клеток B. subtilis БТ-2. Кроме того они являются эффективными антиадгезивными агентами. Исследуемые препараты снижали количество прикрепленных к линолеуму и кафелю клеток B. subtilis БТ-2 на 82,4 и 41,3 % соответственно. Также препараты ПАВ снижали адгезию E. coli ИЭМ-1 на стальные пластинки (на 41 %), пластик (15 %) и кафель (14 %). В тоже время в присутствии ПАВ увеличивалось количество прикрепленных к пластику клеток B. subtilis БТ-2 и к линолеуму − E. coli ИЭМ-1. Адгезии клеток бацилл на сталь не наблюдалось.
Известно, что антимикробное и антиадгезивное действие зависит от физиологического состояния тест-культур. Кроме того актуальным остается вопрос поиска антимикробных и антиадгезивных препаратов против резистентных споровых микроорганизмов. Установлено, что ПАВ A. calcoaceticus K-4 эффективнее действовали на споровые клетки (снижали количество клеток на 72-75 %; адгезию – 86 % на линолеуме и 46 % на кафеле), чем на вегетативные (до 45-47 %; 79 % на линолеуме и 39 % на кафеле).
В исследованиях с эфирным маслом чайного дерева установлено, что количество клеток S. aureus БМС-1 при использовании препарата на основе масла и ПАВ (препарат 1) снижалось на 7–9 % по сравнению с результатами антимикробного действия препарата на основе масла и воды (препарат 3) и на 5–7 % - в случае действия препарата на основе воды и ПАВ (препарат 4). Таким образом, приведенные данные показывают на усиление антимикробного действия масла чайного дерева на клетки бактерий S. aureus  БМС-1 в присутствии поверхностно-активных веществ R. erythropolis ЭК-1 в результате их как антимикробных, так и эмульгирующих свойств.
Установлено, что препараты ПАВ также эффективно действовали на дрожжевые клетки. Так, количество живых клеток C. tropicalis ПБТ-5 в присутствии препаратов ПАВ R. erythropolis ЭК-1 снижалось с повышением концентрации ПАВ и увеличением продолжительности обработки. Наиболее существенное снижение количества дрожжевых клеток наблюдалось при обработке суспензии препаратами ПАВ в наиболее высокой из исследуемых концентраций (1,44 мг/мл) в течение 2 ч. При таких условиях количество живых клеток C. tropicalis ПБТ-5 снижалось на 80%.
На примере C. albicans Д-6 было показано, что не всегда максимальные концентрации являются наиболее эффективными. Так, при внесении препарата ПАВ R. erythropolis ЭК-1 (0,92 мг/мл) выживание клеток составляло 26−33 %, а с увеличением концентрации ПАВ в препарате до 1,44 мг/мл увеличивалось до 43–47 %. Полученные результаты можно объяснить взаимодействием ПАВ и клеток на молекулярном уровне и вспомнить принципы гомеопатии, согласно которым более разбавленные растворы являются более эффективными.
Исследуемые препараты также были эффективны против C. utilis БВС-65. При внесении ПАВ A. calcoaceticus K-4 (0,22 мг/мл) количество дрожжевых клеток через 2 ч экспозиции снижалось на 19 %, а препаратов R. erythropolis ЭК-1 (1,4 мг/мл)  – на 7 %.
Последующие эксперименты показали, что препараты ПАВ R. erythropolis ЭК-1 (0,98–1,47 мг/мл) не проявляли антимикробного действия в отношении бактерий E. coli ИЭМ-1, дрожжей S. cerevisiae ОБ-3 и микромицетов (A. niger Р-3 и F. culmorum Т-7). Вероятно, что для подавления роста этих микроорганизмов необходима более высокая концентрация ПАВ или более длительная обработка. ПАВ A. calcoaceticus K-4 оказались более эффективными и в концентрации 0,22 мг/мл снижали количество клеток  E. coli ИЭМ-1 на 67 %, а S. cerevisiae ОБ-3 – на 48 %.
В опытах с эфирным маслом чайного дерева не было установлено антимикробного действия препарата 4 (препарат ПАВ): выживание A. niger Р-3 составляло 100 % и через 15 мин экспозиции. Однако в присутствии ПАВ наблюдали усиление антимикробного действия эфирного масла на  A. niger Р-3. При использовании такого препарата выживание клеток через 15 мин после обработки составляло 20–21 %. Вполне вероятно, что повышение эффективности препарата 1 обусловлено эмульгирующими свойствами ПАВ R. erythropolis ЕК-1. При использовании препаратов без ПАВ наблюдали увеличение количества живых клеток (до 62 %) через 15 мин экспозиции. Эти результаты свидетельствуют о фунгистатическом (но не фунгицидном) действии масла чайного дерева.
Таким образом, в результате проведенной работы установлено, что поверхностно-активные вещества R. erythropolis ЭК-1 и A. calcoaceticus K-4 обладают антимикробными свойствами в отношении ряда микроорганизмов (C. tropicalis ПБТ-5, B. subtilis БТ-2, C. utilis БВС-65, S. cerevisiae ОБ-3, E. coli ИЭМ-1 и C.albicans Д-6), причем ПАВ A. calcoaceticus K-4 свойственен более широкий спектр действия, хотя в отношении некоторых культур данные препараты менее активны. Выживание клеток в присутствии препаратов ПАВ зависит от их концентрации и продолжительности экспозиции. Через 1–2 ч обработки исследуемыми препаратами ПАВ R. erythropolis ЭК-1 (0,92–1,44 мг/мл) и A. calcoaceticus K-4 (0,15–0,22 мг/мл) наблюдается гибель 100 % клеток B. subtilis БТ-2, 85 % – C. tropicalis ПБТ-5, 74 % – C. albicans Д-6, 67 % – E. coli ИЭМ-1, 48 % – S. cerevisiae ОБ-3 и 18 % – C. utilis БВС-65. Показано, что препараты ПАВ A. calcoaceticus K-4 (0,28 мг/мл) обладают антиадгезивной активностью и снижают количество прикрепленных клеток B. subtilis БТ-2 различного физиологического состояния на линолеуме и кафеле на 79,1–85,8 % и 38,7–45,8 % соответственно и E. coli ИЭМ-1 – на стали (41 %), пластике (15 %) и кафеле (14 %). Установлено, что ПАВ R. erythropolis ЭК-1 усиливают антимикробное действие масла чайного дерева  на некоторые микроорганизмы (A. niger Р-3 и S. aureus БМС-1) благодаря собственным как антимикробным, так  и эмульгирующим свойствам. При одновременном внесении в  суспензию исследуемых тест-культур (104–105 клеток/мл) эмульсии на основе масла чайного дерева (12,5 мкл/мл) и ПАВ (0,43 мг/мл) количество живых клеток через 15 мин экспозиции  было на 0,7–66 % ниже, чем при обработке  суспензии микроорганизмов препаратами масла без поверхностно-активных веществ.

Список литературы
1.    Das P., Mukherjee S., Sen R. Antimicrobial potential of a lipopeptide biosurfactant derived from a marine Bacillus circulans // J. Appl. Microbiol. –2008. –  Vol. 104, № 6. – P.1675–1684.
2.    Rodrigues L., Banat I.M., Teixeira J., Oliveira R. Biosurfactants: potential applications in medicine // J. Antimicrob. Chemother. – 2006. – Vol. 57. – P.609–618.
3.    Mimee B., Labbe C., Pelletier R.,  Belanger R. R. Antifungal Activity of flocculosin, a novel glycolipid isolated from Pseudozyma flocculosa // Antimicrob. Agents Chemother. – 2005. – V. 49. – Р. 1597–1599.
4.    Nitschke M., Araujo  L.V., Costa  S.G.V.A.O., Pires  R.C. at al. Surfactin reduces the adhesion of food-borne pathogenic bacteria to solid surfaces // Let. App. Microbiol. – 2009. – V. 49. – P. 241–247.
5.    Rivardo F., Turner R.J., Allegrone G. at al. Anti-adhesion activity of  two biosurfactants produced by Bacillus spp. prevents biofilm formation of human bacterial pathogens // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2009. – Vol. 83. – P. 541–553.
6.    Пирог Т.П., Шевчук Т.А., Волошина И.Н., Грегирчак Н.Н. Использование иммобилизированных на керамзите клеток нефтеокисляющих микроорганизмов для очистки воды от нефти // Прикладная биохимия и микробиология. – 2005. – Т. 41, № 1. – С.58–63.
7.    Пирог Т.П., Антонюк С.И., Карпенко Е.В., Шевчук Т.А. Влияние условий культивирования штамма Acinetobacter calcoaceticus K-4 на синтез поверхностно-активных веществ // Прикладная биохимия и микробиология. – 2009. – Т.45, № 3. – С. 304–310.
8.    Пирог Т.П., Шевчук Т.А., Волошина И.Н., Карпенко Е.И. Образование поверхностно-активных веществ при росте штамма Rhodococcus erythropolis ЭК-1 на гидрофильных и гидрофобных субстратах // Прикладная биохимия и микробиология. – 2004. – Т. 40, № 5 . – С. 544– 550.