Labirint.ru - ваш проводник по лабиринту книг
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -ГлавнаяОб АльманахеРецензентыАрхив телеконференций- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -Сборники АльманахаДругие сборникиНаучные труды- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -Образец оформленияИнформационное письмоО проведении телеконференции- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -Материалы I телеконференцииМатериалы II телеконференцииМатериалы III телеконференцииМатериалы IV телеконференцииМатериалы V телеконференцииМатериалы VI телеконференцииМатериалы VII телеконференцииМатериалы VIII телеконференцииМатериалы IX телеконференцииМатериалы Х телеконференцииМатериалы XI телеконференцииМатериалы XII телеконференцииМатериалы XIII телеконференцииУчастники XIII телеконференцииМатериалы XIV телеконференцииУчастники XIV телеконференцииЮбилейная XV Телеконференция Октябрь 2014Участники Юбилейной XV Телеконференции- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -Конференция СМПиЧ-2015Участники СМПиЧ-2015- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -КонтактыФорум
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -Поиск по сайту

Последние статьи

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ЛИМФОЦИТОВ У БОЛЬНЫХ ИКСОДОВЫМ КЛЕЩЕВЫМ БОРРЕЛИОЗОМ ВЛИЯНИЕ ВИРУСНОИ ИНФЕКЦИИ КЛЕЩЕВЫМ ЭНЦЕФАЛИТОМ НА ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ПРЕДИКТОРЫ БОЛЕЗНИ РОЛЬ ГЕНА GSTM1 В ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЯХ КЛЕТОК КРОВИ и ПАТОЛОГИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЯХ СПЕРМАТОЗОИДОВ ПРИ ГРАНУЛОЦИТАРНОМ АНАПЛАЗМОЗЕ ЧЕЛОВЕКА ГЕНЕТИЧЕСКИИ ПОЛИМОРФИЗМ И ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ Т- ЛИМФОЦИТОВ У БОЛЬНЫХ АРТРИТОМ, АССОЦИИРОВАННЫМ В КЛЕЩЕВЫМ БОРРЕЛИОЗОМ КЛИНИЧЕСКИЕ ПОСЛЕДСТВИЯ ИКСОДОВОГО ВЕСЕННЕ-ЛЕТНЕГО КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫИ СТАТУС И АДАПТИВНЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ ОРГАНИЗМА ПЕРВОКЛАССНИКОВ ШКОЛ г. НЕФТЕЮГАНСКА ТЮМЕНСКОИ ОБЛАСТИ Материалы трудов участников 14-ой международной выездной конференции русскоязычных ученых в Китае (Sanya, Haynan Island) "Современный мир, природа и человек", том 8, №3. ПРОЛИФЕРАТИВНЫЕ И АПОПТОТИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ В ЛИМФОЦИТАХ КРОВИ БОЛЬНЫХ ИКСОДОВЫМ КЛЕЩЕВЫМ БОРРЕЛИОЗОМ В ПРОЦЕССЕ СТИМУЛЯЦИИ АНТИГЕНОМ БОРРЕЛИИ THE ANALYSIS OF SOME INDICES OF IMMUNERESPONSE, DNA REPAIR, AND MICRONUCLEI CONTENT IN CELLS FROM TICK-BORNE ENCEPHALITIS PATIENTS КОМПЬЮТЕРНЫИ СПЕКТРАЛЬНЫИ МОРФОМЕТРИЧЕСКИИ АНАЛИЗ МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТОК ПЕРИФЕРИЧЕСКОИ КРОВИ У БОЛЬНЫХ ИКСОДОВЫМ КЛЕЩЕВЫМ БОРРЕЛИОЗОМ И ГРАНУЛОЦИТАРНЫМ ЭРЛИХИОЗОМ ЧЕЛОВЕКА

Полезная информация

 
 

ПРОТИВООПУХОЛЕВАЯ АКТИВНОСТЬ ПАКЛИТАКСЕЛА, ВКЛЮЧЕННОГО В МАТРИКС ПОЛИМЕРНЫХ НАНОЧАСТИЦ

Печать E-mail
Автор Боят В. и соавт.   
22.05.2010 г.
Эта работа опубликована в сборнике статей с материалами трудов 2-ой международной телеконференции "Проблемы и перспективы современной медицины, биологии и экологии". Название сборника "Фундаментальные науки и практика Том 1, №2"

Посмотреть обложку сборника

Скачать информацию о сборнике (в архиве: обложка, тит. лист, оглавление, список авторов)

 
Авторы: Боят В., Баранов Д.С., Оганесян Е.А., Хамди Я.М., Балабаньян В.Ю.,  Аляутдин Р.Н.

ГОУ ВПО Московская Медицинская Академия им. И.М. Сеченова, кафедра фармакологии фармацевтического факультета (Москва)

Реферат
Методом соосаждения получена лекарственная форма паклитаксела, включенного наночастицы (НЧ) на основе сополимера молочной и гликолевой кислот с размером в субмикронном диапазоне. В экспериментах in vitro исследована возможность контролируемого высвобождения паклитаксела в среде при рН 7.4 в течение 24 часов. В экспериментах на клетках Т-лимфобластного лейкоза человека Jurkat/WT было показано, что вкючение паклитаксела в НЧ приводило к 4-кратному повышению его цитотоксичности  (6.8*10-6 М) по сравнению с раствором паклитаксела. Эффективность композиций, содержащих полисорбат-80, сопоставима с немодифицированными паклитаксел-содержащими наночастицами.

Ключевые слова
Паклитаксел, наночастицы, in vitro, Jurkat, P-гликопротеин


Введение
Паклитаксел – химиотерапевтическое средство из группы таксанов, которое ингибирует деполимеризацию тубулиновых микротрубочек, замораживая таким образом клетку в метафазе, что приводит к развитию антиангиогенного и антиапоптотического действия. Широкое применение плохо растворимого паклитаксела в онкологии ограничивается высокой токсичностью его лекарственной формы в том числе и за счет добавления растворителя. Паклитаксел является субстратом для Р-гликопротеина, фактора, во многом определяющего множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток [3]. Несмотря на повышенную проницаемость капилляров в опухоли, P-гликопротеин эффективно снижает концентрацию паклитаксела в опухолевых тканях [7]. В связи с этим актуальной проблемой является поиск путей преодоления факторов устойчивости опухолевых клеток и снижения токсичности паклитаксела. 
Известно, что включение лекарственных веществ в наноразмерные носители приводит к увеличению внутриклеточной доставки лекарственных веществ, в том числе и в случаях экспрессии в мембранах Р-гликопротеина. Действительно, наночастицы способны подвергаться эндоцитозу, что обеспечивает эффективный внутриклеточный транспорт лекарственных веществ, в том числе субстратов P-гликопротеина, таких как паклитаксел. Эффект повышенной проницаемости новообразованных капилляров опухоли также приводит к накоплению и выходу наночастиц из сосудистого русла в зоне опухолевого роста. Покрытие наночастиц рядом поверхностно-активных веществ ингибирует P-гликопротеин. Наносомальная форма паклитаксела на основе альбуминовых наночастиц несмотря на широкое применение в онкологической практике, незначительно повысила биодоступность и безопасность паклитаксела. 
Одними из наиболее широко применяемых материалов, используемых для получения наночастиц, являются сополимеры молочной и гликолевой кислот (ПЛГА). Это биодеградируемые и биосовместимые полимеры; наночастицы на их основе обеспечивают эффективную сорбцию и контролируемое высвобождение лекарственных веществ. Имеются работы, в которых описано получение микро-, наночастиц с паклитакселом, в том числе, на основе ПЛГА, продемонстрирована их биологическая активность in vitro, in vivo [9,10]. Вместе с тем, в ряде работ наночастицы на основе ПЛГА сами по себе не повышали эффективность паклитаксела. Так, в работе М. Chavanpatil и соавт. (2006) цитотоксический эффект паклитаксел-содержащих наночастиц был продемонстрирован только в присутствии ингибиторов P-гликопротеина [1]. В связи с этим оправданно включение в состав лекарственной формы поверхностно-активных веществ – ингибиторов P-гликопротеина, таких как полисорбат 80.
Таким образом, целью настоящего исследования стали разработка лабораторной методики получения наночастиц на основе ПЛГА,  изучение их цитотоксической активности против клеток Т-лимфобластного лейкоза человека (Jurkat/WT), изучение влияния полисорбата 80 на цитотоксический эффект паклитаксела.

Материалы и методы
В работе использовали: паклитаксел (Calbiochem, США), сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA) с соотношением звеньев 50/50 и характеристической вязкостью в гексафторизопропаноле 0.37 (Absorbable Polymers International, США). Степень чистоты остальных реактивов и растворителей была не ниже «хч».
Получение наночастиц
Для получения наночастиц модифицировали известную методику соосаждения [5]. 0.5 – 30 мг паклитаксела, 100 мг PLGA растворяли в 5 мл ацетона. Этот раствор смешивали с 10 мл 1 водным раствором полоксамера 407, образовавшуюся суспензию перемешивали при нагревании (50 – 60 градусов) при помощи магнитной мешалки в течение 2 – 3 часов для удаления органического растворителя, после чего суспензию фильтровали через бумажный фильтр «белая лента» (размер пор 3 мкм) и лиофилизовали. Пустые наночастицы (контрольную форму) получали аналогично, без использования паклитаксела.
Количественное определение паклитаксела в лекарственной форме.
Содержание паклитаксела в лиофильно высушенных образцах определяли хроматографически после обработки образца метанолом для растворения паклитаксела и разрушения наночастиц. Выход паклитаксела (в процентах) определяли как соотношение паклитаксела, найденного в образце, к введенному в синтез.
Изучение цитотоксической активности паклитаксела и его наносомальных лекарственных форм.
Лекарственные формы. Лиофилизированные образцы наночастиц редиспергировали в воде для инъекций или в 2% растворе полисорбата 80 (твина) до получения гомогенной суспензии. Таким образом, исследовали 4 формы: паклитаксел, наночастицы + твин, паклитатаксел + наночастицы, паклитаксел + наночастицы + твин.
Инкубация клеток. Клетки Jurkat/WT, находящиеся в экспоненциальной фазе роста, в свежей питательной среде (90% RPMI 1640 без глутамина, 10% FBS-эмбриональная телячья сыворотка, витамины, незаменимые аминокислоты, L-глутамин)  пересевали в лунки 96- или 24-лучночного планшета (50-100 тыс. клеток в лунку), инкубировали в атмосфере 5% CO2 при 37С и через 12 ч. инкубации вносили аликвоты исследуемых форм до получения концентраций 10-4 М – 5*10-7 М паклитаксела. Клетки инкубировали в присутствии различных концентраций препаратов при 37С в атмосфере 5% СО2 в течение 24 часов. Контролем служили интактные клетки, инкубированные в тех же условиях, но без препаратов.
MTT-тест.  Для оценки цитостатического действия препаратов использовали МТТ-тест, который основан на способности дегидрогеназ живых клеток превращать бледно-желтый водорастворимый 3-(4,5-диметилтриазол-2-ил)2,5-дифенил-2-Н-тетразолия бромид (МТТ) в нерастворимые в воде голубые кристаллы формазана. Количество образовавшегося формазана, определямое колориметрическим методом после его растворения в органических растворителях, характеризует интенсивность окислительно-восстановительных процессов в клеточных культурах  и является косвенной количественной характеристикой активной биомассы.
В клеточные культуры, растущие определенное время в лунках 96-луночных плоскодонных планшетов с цитотоксинами или без них (контрольные и опытные образцы) за 4-6 часов до окончания расчетного периода инкубации вносили по 10 мкл раствора МТТ (стоковый раствор 5 мг/мл, Sigma, USA). По окончании инкубации клетки осаждали центрифугированием планшетов при 1000 об./мин. в течение 5-7 минут. Супернатант осторожно отбирали, вносили в каждую лунку по 60 мкл ДМСО (Sigma, USA), осадки ресуспендировали и инкубировали 30 минут при 37С, после чего немедленно определяли оптическую плотность раствора формазана, используя спектрофотометр вертикального сканирования Titerteck Multiscan MCC/340 (Flow Lab., USA) при длине волны 540 нм. Результаты измерения обрабатывали с использованием программы Elisafit.

Результаты исследования
Наночастицы получали так называемым методом соосаждения [5, 6]. Нерастворимые в воде паклитаксел и ПЛГА носитель растворяли в смешивающемся с водой органическом растворителе (ацетоне), образовавшуюся органическую фазу добавляли к водной фазе, содержащей поверхностно-активное вещество (полоксамер 188). По мере удаления органического растворителя, растворимость паклитаксела и полимера снижается, что, при правильном подборе параметров синтеза, приводит к образованию частиц субмикронного размера (250-300 нм).
Ранее нами было изучено влияние различных технологических параметров на физико-химические свойства лекарственной формы, в частности, на выход лекарственного вещества. Продемонстрировано, что при использовании соотношения паклитаксел:ПЛГА 1:100 и ниже синтез наночастиц проходит практически без потерь лекарственного вещества и полимера.
Полученная лекарственная форма была устойчива к замораживанию и последующей лиофилизации: суспензия не теряла агрегативной устойчивости после, по меньшей мере, 3 циклов «-200С – комнатная температура», а добавление воды или раствора полисорбата 80 к лиофилизату приводило к образованию гомогенной суспензии. Таким образом, экспериментальная лекарственная форма стабильна и может быть пригодна как для перорального, так и для внутривенного введения. Наносомальная форма обеспечивала плавное высвобождение паклитаксела в течение 24 часов в фосфатном буфере (рН 7.4), то есть в среде, имитирующей плазму крови и внутриклеточную жидкость. Введение в инкубационную среду полисорбата 80 в качестве солюбилизатора обеспечивало немного более высокую скорость высвобождения паклитаксела по сравнению с немодифицированным фосфатным буфером.
Использование полисорбата 80 было связано не только с его способностью солюбилизировать трудно растворимый паклитаксел. Известно, что полисорбат-80 способен ингибировать р-гликопротеин – мембранный белок, ответственный за обратный транспорт ксенобиотиков во внеклеточную среду. Кроме того, полисорбат-80 способен сорбировать из окружающей жидкой фазы аполипопротеин Е. Это считается одним из механизмов, обеспечивающих транспорт наночастиц различной природы, в том числе ПЛГА-наночастиц, через гематоэнцефалический барьер [1,7-9,14,15]. Р-гликопротеин экспрессирован клетками Т-лимфобластного лейкоза человека Jurkat/WT, в связи с этим представляло интерес сравнить цитотоксическую активность паклитаксел-содержащих наночастиц не только со свободным паклитакселем, но и с композициями, содержащими полисорбат-80.
Цитотоксический эффект различных форм паклитаксела представлен на рисунке 1. Снижение концентрации паклитаксела с 1*10-4М до 6.8*10-6М приводило к постепенному снижению его цитотоксичности, и в концентрации 6.8*10-6 М количество жизнеспособных клеток составляло 90% по отношению к интактному контролю (т.е. к  ростовой среде, в которую вместо препаратов вносили фосфатный буфер). Очевидно, что в бо/льших разведениях паклитаксел неэффективен. В связи с этим, эффективность наносомальных препаратов начали изучать с концентрации 6.8*10-6 М.
Оказалось, что в этой концентрации наносомальные формы паклитаксела проявили существенно более выраженный цитотоксический эффект – жизнеспособность сохранили не более 30-40 % клеток. Разница, пусть и менее значимая, была продемонстрирована и при использовании меньших разведений - 10-6 М и 5*10-7 М (рисунок 1).
 Использование полисорбата-80 само по себе не увеличивало эффективность лекарственного вещества, и в диапазоне концентраций 6.8*10-6 М – 5*10-7 М  жизнеспособность сохраняли до 95% клеток. Эффективность ПЛГА-содержащих наночастиц, покрытых полисорбатом 80, была сопоставима с немодифицированными паклитаксел-содержащими наночастицами – в концентрации 6.8*10-6 М сохраняли жизнеспособность около 40% клеток, в концентрациях 10-6 М и 5*10-7 М – около 80%.
Таким образом, в наших экспериментах продемонстрировано, что наночастицы на основе ПЛГА способны повышать цитотоксичность паклитаксела в отношении р-гликопротеин-позитивных клеток Jurkat без использования полисорбата 80. Наши результаты согласуются с литературными данными. Так, в работе Musyanovych A с соавт. (2008) было показано, что полимерные наночастицы подвергаются эффективному эндоцитозу клетками Jurkat, причем скорость эндоцитоза зависела, в числе прочего, от материала наночастиц и свойств поверхности, и наночастицы на основе полимолочной кислоты и ее сополимеров захватывались достаточно быстро [11]. В  работе Chen K (2009) было продемонстрировано, что наночастицы на основе альбумина человека слегка повышают фототоксический эффект феофорбида против клеток Jurkat [4]. Использование ПЛГА-наночастиц повышает антиапоптотический и антипролиферативный эффект куркумина против различных опухолевых клеточных линий, в том числе лейкемических клеток [2]. Отсутствие разницы цитотоксического действия между ПЛГА наночастицами и ПЛГА наночастицами, покрытыми полисорбатом 80, может объясняться отсутствием апоЕ и апоВ в инкубационной среде, либо недостаточной сорбцией ПЛГА полисорбата 80.
Таким образом, разработана новая лекарственная форма паклитаксела на основе сополимеров молочной и гликолевой кислот, пригодная как для перорального, так и для внутривнного введения, с размером частиц в субмикронном диапазоне. Предложенный метод нанопреципитации позволяет получать лекарственную форму практически без потерь паклитаксела и вспомогательных веществ. Продемонстрировано контролируемое высвобождение паклитаксела при рН 7.4 в течение 24 часов, в том числе в среде, содержащей солюбилизатор полисорбат-80. Использование наночастиц приводит к 4-кратному повышению цитотоксичности паклитаксела против клеток Т-лимфобластного лейкоза человека Jurkat/WT. Есть основания полагать, что полученная лекарственная форма позволит повысить противоопухолевый эффект паклитаксела не только в условиях in vitro, но и в условиях in vivo.

Список литературы

[1]    A. Ambruosi, A.S. Khalansky, H. Yamamoto, et. al., Biodistribution of polysorbate 80-coated doxorubicin-loaded [14C]-poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles after intravenous administration to glioblastoma-bearing rats. J Drug Target 14(2) (2006) 97-105.
[2]    P. Anand, H.B. Nair, B. Sung, et. al., Design of curcumin-loaded PLGA nanoparticles formulation with enhanced cellular uptake, and increased bioactivity in vitro and superior bioavailability in vivo. Biochem Pharmacol 79(3) (2010) 330-338.
[3]    M.D. Chavanpatil, Y. Patil, J. Panyam, Susceptibility of nanoparticle-encapsulated paclitaxel to P-glycoprotein-mediated drug efflux. Int J Pharm 320(1-2) (2006) 150-156.
[4]    K. Chen, A. Preuss, S. Hackbarth, et. al., Novel photosensitizer-protein nanoparticles for photodynamic therapy: photophysical characterization and in vitro investigations. J Photochem Photobiol B 96(1) (2009) 66-74.
[5]    C. Fonseca, S. Simoes, R. Gaspar, Paclitaxel-loaded PLGA nanoparticles: preparation, physicochemical characterization and in vitro anti-tumoral activity. J Control Release 83(2) (2002) 273-286.
[6]    S.A. Galindo-Rodriguez, F. Puel, S. Briancon, et. al., Comparative scale-up of three methods for producing ibuprofen-loaded nanoparticles. Eur J Pharm Sci 25(4-5) (2005) 357-367.
[7]    J.M. Gallo, S. Li, P. Guo, K. Reed, et. al., The effect of P-glycoprotein on paclitaxel brain and brain tumor distribution in mice. Cancer Res 63(16) (2003) 5114-5117.
[8]    K.K. Halder, B. Mandal, M.C. Debnath, et. al., Chloramphenicol-incorporated poly lactide-co-glycolide (PLGA) nanoparticles: formulation, characterization, technetium-99m labeling and biodistribution studies. J Drug Target 16(4) (2008) 311-320.
[9]    J.M. Koziara, P.R. Lockman, D.D. Allen, R.J. Mumper, Paclitaxel nanoparticles for the potential treatment of brain tumors. J Control Release 99(2) (2004) 259-269.
[10]    R.T. Liggins, H.M. Burt, Paclitaxel loaded poly(L-lactic acid) (PLLA) microspheres. II. The effect of processing parameters on microsphere morphology and drug release kinetics. Int J Pharm 281(1-2) (2004) 103-106.
[11]    A. Musyanovych, J. Schmitz-Wienke, V. Mailander, et. al., Preparation of biodegradable polymer nanoparticles by miniemulsion technique and their cell interactions. Macromol Biosci 8(2) (2008) 127-139.
[12]    I. Reimold, D. Domke, J. Bender, et. al., Delivery of nanoparticles to the brain detected by fluorescence microscopy. Eur J Pharm Biopharm 70(2) (2008) 627-632.
[13]    W. Sun, C. Xie, H. Wang, Y. Hu, Specific role of polysorbate 80 coating on the targeting of nanoparticles to the brain. Biomaterials 25(15) (2004) 3065-3071.
[14]    B. Wilson, M.K. Samanta, K. Santhi, et. al., Poly(n-butylcyanoacrylate) nanoparticles coated with polysorbate 80 for the targeted delivery of rivastigmine into the brain to treat Alzheimer's disease. Brain Res 1200 (2008) 159-168.
[15]    B. Wilson, M.K. Samanta, K. Santhi, et. al., Targeted delivery of tacrine into the brain with polysorbate 80-coated poly(n-butylcyanoacrylate) nanoparticles. Eur J Pharm Biopharm 70(1) (2008) 75-84.
 
Image
 
Рисунок 1. Цитотоксическая активность различных лекарственных форм паклитаксела против клеток Jurkat/WT
Последнее обновление ( 21.10.2010 г. )
 

Добавить комментарий

Правила! Запрещается ругаться матом, оскорблять участников/авторов, спамить, давать рекламу.



Защитный код
Обновить

« Пред.   След. »
 
 
Альманах Научных Открытий. Все права защищены.
Copyright (c) 2008-2021.
Копирование материалов возможно только при наличии активной ссылки на наш сайт.

Warning: require_once(/home/users/z/zverkoff/domains/tele-conf.ru/templates/css/llm.php) [function.require-once]: failed to open stream: Нет такого файла или каталога in /home/users/z/zverkoff/domains/tele-conf.ru/templates/bioinformatix/index.php on line 99

Fatal error: require_once() [function.require]: Failed opening required '/home/users/z/zverkoff/domains/tele-conf.ru/templates/css/llm.php' (include_path='.:/usr/local/zend-5.2/share/pear') in /home/users/z/zverkoff/domains/tele-conf.ru/templates/bioinformatix/index.php on line 99