Ключевые слова
Паклитаксел, наночастицы, in vitro, Jurkat, P-гликопротеин
Введение
Паклитаксел – химиотерапевтическое средство из группы таксанов, которое ингибирует деполимеризацию тубулиновых микротрубочек, замораживая таким образом клетку в метафазе, что приводит к развитию антиангиогенного и антиапоптотического действия. Широкое применение плохо растворимого паклитаксела в онкологии ограничивается высокой токсичностью его лекарственной формы в том числе и за счет добавления растворителя. Паклитаксел является субстратом для Р-гликопротеина, фактора, во многом определяющего множественную лекарственную устойчивость опухолевых клеток [3]. Несмотря на повышенную проницаемость капилляров в опухоли, P-гликопротеин эффективно снижает концентрацию паклитаксела в опухолевых тканях [7]. В связи с этим актуальной проблемой является поиск путей преодоления факторов устойчивости опухолевых клеток и снижения токсичности паклитаксела.
Известно, что включение лекарственных веществ в наноразмерные носители приводит к увеличению внутриклеточной доставки лекарственных веществ, в том числе и в случаях экспрессии в мембранах Р-гликопротеина. Действительно, наночастицы способны подвергаться эндоцитозу, что обеспечивает эффективный внутриклеточный транспорт лекарственных веществ, в том числе субстратов P-гликопротеина, таких как паклитаксел. Эффект повышенной проницаемости новообразованных капилляров опухоли также приводит к накоплению и выходу наночастиц из сосудистого русла в зоне опухолевого роста. Покрытие наночастиц рядом поверхностно-активных веществ ингибирует P-гликопротеин. Наносомальная форма паклитаксела на основе альбуминовых наночастиц несмотря на широкое применение в онкологической практике, незначительно повысила биодоступность и безопасность паклитаксела.
Одними из наиболее широко применяемых материалов, используемых для получения наночастиц, являются сополимеры молочной и гликолевой кислот (ПЛГА). Это биодеградируемые и биосовместимые полимеры; наночастицы на их основе обеспечивают эффективную сорбцию и контролируемое высвобождение лекарственных веществ. Имеются работы, в которых описано получение микро-, наночастиц с паклитакселом, в том числе, на основе ПЛГА, продемонстрирована их биологическая активность in vitro, in vivo [9,10]. Вместе с тем, в ряде работ наночастицы на основе ПЛГА сами по себе не повышали эффективность паклитаксела. Так, в работе М. Chavanpatil и соавт. (2006) цитотоксический эффект паклитаксел-содержащих наночастиц был продемонстрирован только в присутствии ингибиторов P-гликопротеина [1]. В связи с этим оправданно включение в состав лекарственной формы поверхностно-активных веществ – ингибиторов P-гликопротеина, таких как полисорбат 80.
Таким образом, целью настоящего исследования стали разработка лабораторной методики получения наночастиц на основе ПЛГА, изучение их цитотоксической активности против клеток Т-лимфобластного лейкоза человека (Jurkat/WT), изучение влияния полисорбата 80 на цитотоксический эффект паклитаксела.
Материалы и методы
В работе использовали: паклитаксел (Calbiochem, США), сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA) с соотношением звеньев 50/50 и характеристической вязкостью в гексафторизопропаноле 0.37 (Absorbable Polymers International, США). Степень чистоты остальных реактивов и растворителей была не ниже «хч».
Получение наночастиц
Для получения наночастиц модифицировали известную методику соосаждения [5]. 0.5 – 30 мг паклитаксела, 100 мг PLGA растворяли в 5 мл ацетона. Этот раствор смешивали с 10 мл 1 водным раствором полоксамера 407, образовавшуюся суспензию перемешивали при нагревании (50 – 60 градусов) при помощи магнитной мешалки в течение 2 – 3 часов для удаления органического растворителя, после чего суспензию фильтровали через бумажный фильтр «белая лента» (размер пор 3 мкм) и лиофилизовали. Пустые наночастицы (контрольную форму) получали аналогично, без использования паклитаксела.
Количественное определение паклитаксела в лекарственной форме.
Содержание паклитаксела в лиофильно высушенных образцах определяли хроматографически после обработки образца метанолом для растворения паклитаксела и разрушения наночастиц. Выход паклитаксела (в процентах) определяли как соотношение паклитаксела, найденного в образце, к введенному в синтез.
Изучение цитотоксической активности паклитаксела и его наносомальных лекарственных форм.
Лекарственные формы. Лиофилизированные образцы наночастиц редиспергировали в воде для инъекций или в 2% растворе полисорбата 80 (твина) до получения гомогенной суспензии. Таким образом, исследовали 4 формы: паклитаксел, наночастицы + твин, паклитатаксел + наночастицы, паклитаксел + наночастицы + твин.
Инкубация клеток. Клетки Jurkat/WT, находящиеся в экспоненциальной фазе роста, в свежей питательной среде (90% RPMI 1640 без глутамина, 10% FBS-эмбриональная телячья сыворотка, витамины, незаменимые аминокислоты, L-глутамин) пересевали в лунки 96- или 24-лучночного планшета (50-100 тыс. клеток в лунку), инкубировали в атмосфере 5% CO2 при 37С и через 12 ч. инкубации вносили аликвоты исследуемых форм до получения концентраций 10-4 М – 5*10-7 М паклитаксела. Клетки инкубировали в присутствии различных концентраций препаратов при 37С в атмосфере 5% СО2 в течение 24 часов. Контролем служили интактные клетки, инкубированные в тех же условиях, но без препаратов.
MTT-тест. Для оценки цитостатического действия препаратов использовали МТТ-тест, который основан на способности дегидрогеназ живых клеток превращать бледно-желтый водорастворимый 3-(4,5-диметилтриазол-2-ил)2,5-дифенил-2-Н-тетразолия бромид (МТТ) в нерастворимые в воде голубые кристаллы формазана. Количество образовавшегося формазана, определямое колориметрическим методом после его растворения в органических растворителях, характеризует интенсивность окислительно-восстановительных процессов в клеточных культурах и является косвенной количественной характеристикой активной биомассы.
В клеточные культуры, растущие определенное время в лунках 96-луночных плоскодонных планшетов с цитотоксинами или без них (контрольные и опытные образцы) за 4-6 часов до окончания расчетного периода инкубации вносили по 10 мкл раствора МТТ (стоковый раствор 5 мг/мл, Sigma, USA). По окончании инкубации клетки осаждали центрифугированием планшетов при 1000 об./мин. в течение 5-7 минут. Супернатант осторожно отбирали, вносили в каждую лунку по 60 мкл ДМСО (Sigma, USA), осадки ресуспендировали и инкубировали 30 минут при 37С, после чего немедленно определяли оптическую плотность раствора формазана, используя спектрофотометр вертикального сканирования Titerteck Multiscan MCC/340 (Flow Lab., USA) при длине волны 540 нм. Результаты измерения обрабатывали с использованием программы Elisafit.
Результаты исследования
Наночастицы получали так называемым методом соосаждения [5, 6]. Нерастворимые в воде паклитаксел и ПЛГА носитель растворяли в смешивающемся с водой органическом растворителе (ацетоне), образовавшуюся органическую фазу добавляли к водной фазе, содержащей поверхностно-активное вещество (полоксамер 188). По мере удаления органического растворителя, растворимость паклитаксела и полимера снижается, что, при правильном подборе параметров синтеза, приводит к образованию частиц субмикронного размера (250-300 нм).
Ранее нами было изучено влияние различных технологических параметров на физико-химические свойства лекарственной формы, в частности, на выход лекарственного вещества. Продемонстрировано, что при использовании соотношения паклитаксел:ПЛГА 1:100 и ниже синтез наночастиц проходит практически без потерь лекарственного вещества и полимера.
Полученная лекарственная форма была устойчива к замораживанию и последующей лиофилизации: суспензия не теряла агрегативной устойчивости после, по меньшей мере, 3 циклов «-200С – комнатная температура», а добавление воды или раствора полисорбата 80 к лиофилизату приводило к образованию гомогенной суспензии. Таким образом, экспериментальная лекарственная форма стабильна и может быть пригодна как для перорального, так и для внутривенного введения. Наносомальная форма обеспечивала плавное высвобождение паклитаксела в течение 24 часов в фосфатном буфере (рН 7.4), то есть в среде, имитирующей плазму крови и внутриклеточную жидкость. Введение в инкубационную среду полисорбата 80 в качестве солюбилизатора обеспечивало немного более высокую скорость высвобождения паклитаксела по сравнению с немодифицированным фосфатным буфером.
Использование полисорбата 80 было связано не только с его способностью солюбилизировать трудно растворимый паклитаксел. Известно, что полисорбат-80 способен ингибировать р-гликопротеин – мембранный белок, ответственный за обратный транспорт ксенобиотиков во внеклеточную среду. Кроме того, полисорбат-80 способен сорбировать из окружающей жидкой фазы аполипопротеин Е. Это считается одним из механизмов, обеспечивающих транспорт наночастиц различной природы, в том числе ПЛГА-наночастиц, через гематоэнцефалический барьер [1,7-9,14,15]. Р-гликопротеин экспрессирован клетками Т-лимфобластного лейкоза человека Jurkat/WT, в связи с этим представляло интерес сравнить цитотоксическую активность паклитаксел-содержащих наночастиц не только со свободным паклитакселем, но и с композициями, содержащими полисорбат-80.
Цитотоксический эффект различных форм паклитаксела представлен на рисунке 1. Снижение концентрации паклитаксела с 1*10-4М до 6.8*10-6М приводило к постепенному снижению его цитотоксичности, и в концентрации 6.8*10-6 М количество жизнеспособных клеток составляло 90% по отношению к интактному контролю (т.е. к ростовой среде, в которую вместо препаратов вносили фосфатный буфер). Очевидно, что в бо/льших разведениях паклитаксел неэффективен. В связи с этим, эффективность наносомальных препаратов начали изучать с концентрации 6.8*10-6 М.
Оказалось, что в этой концентрации наносомальные формы паклитаксела проявили существенно более выраженный цитотоксический эффект – жизнеспособность сохранили не более 30-40 % клеток. Разница, пусть и менее значимая, была продемонстрирована и при использовании меньших разведений - 10-6 М и 5*10-7 М (рисунок 1).
Использование полисорбата-80 само по себе не увеличивало эффективность лекарственного вещества, и в диапазоне концентраций 6.8*10-6 М – 5*10-7 М жизнеспособность сохраняли до 95% клеток. Эффективность ПЛГА-содержащих наночастиц, покрытых полисорбатом 80, была сопоставима с немодифицированными паклитаксел-содержащими наночастицами – в концентрации 6.8*10-6 М сохраняли жизнеспособность около 40% клеток, в концентрациях 10-6 М и 5*10-7 М – около 80%.
Таким образом, в наших экспериментах продемонстрировано, что наночастицы на основе ПЛГА способны повышать цитотоксичность паклитаксела в отношении р-гликопротеин-позитивных клеток Jurkat без использования полисорбата 80. Наши результаты согласуются с литературными данными. Так, в работе Musyanovych A с соавт. (2008) было показано, что полимерные наночастицы подвергаются эффективному эндоцитозу клетками Jurkat, причем скорость эндоцитоза зависела, в числе прочего, от материала наночастиц и свойств поверхности, и наночастицы на основе полимолочной кислоты и ее сополимеров захватывались достаточно быстро [11]. В работе Chen K (2009) было продемонстрировано, что наночастицы на основе альбумина человека слегка повышают фототоксический эффект феофорбида против клеток Jurkat [4]. Использование ПЛГА-наночастиц повышает антиапоптотический и антипролиферативный эффект куркумина против различных опухолевых клеточных линий, в том числе лейкемических клеток [2]. Отсутствие разницы цитотоксического действия между ПЛГА наночастицами и ПЛГА наночастицами, покрытыми полисорбатом 80, может объясняться отсутствием апоЕ и апоВ в инкубационной среде, либо недостаточной сорбцией ПЛГА полисорбата 80.
Таким образом, разработана новая лекарственная форма паклитаксела на основе сополимеров молочной и гликолевой кислот, пригодная как для перорального, так и для внутривнного введения, с размером частиц в субмикронном диапазоне. Предложенный метод нанопреципитации позволяет получать лекарственную форму практически без потерь паклитаксела и вспомогательных веществ. Продемонстрировано контролируемое высвобождение паклитаксела при рН 7.4 в течение 24 часов, в том числе в среде, содержащей солюбилизатор полисорбат-80. Использование наночастиц приводит к 4-кратному повышению цитотоксичности паклитаксела против клеток Т-лимфобластного лейкоза человека Jurkat/WT. Есть основания полагать, что полученная лекарственная форма позволит повысить противоопухолевый эффект паклитаксела не только в условиях in vitro, но и в условиях in vivo.
Список литературы
[1] A. Ambruosi, A.S. Khalansky, H. Yamamoto, et. al., Biodistribution of polysorbate 80-coated doxorubicin-loaded [14C]-poly(butyl cyanoacrylate) nanoparticles after intravenous administration to glioblastoma-bearing rats. J Drug Target 14(2) (2006) 97-105.
[2] P. Anand, H.B. Nair, B. Sung, et. al., Design of curcumin-loaded PLGA nanoparticles formulation with enhanced cellular uptake, and increased bioactivity in vitro and superior bioavailability in vivo. Biochem Pharmacol 79(3) (2010) 330-338.
[3] M.D. Chavanpatil, Y. Patil, J. Panyam, Susceptibility of nanoparticle-encapsulated paclitaxel to P-glycoprotein-mediated drug efflux. Int J Pharm 320(1-2) (2006) 150-156.
[4] K. Chen, A. Preuss, S. Hackbarth, et. al., Novel photosensitizer-protein nanoparticles for photodynamic therapy: photophysical characterization and in vitro investigations. J Photochem Photobiol B 96(1) (2009) 66-74.
[5] C. Fonseca, S. Simoes, R. Gaspar, Paclitaxel-loaded PLGA nanoparticles: preparation, physicochemical characterization and in vitro anti-tumoral activity. J Control Release 83(2) (2002) 273-286.
[6] S.A. Galindo-Rodriguez, F. Puel, S. Briancon, et. al., Comparative scale-up of three methods for producing ibuprofen-loaded nanoparticles. Eur J Pharm Sci 25(4-5) (2005) 357-367.
[7] J.M. Gallo, S. Li, P. Guo, K. Reed, et. al., The effect of P-glycoprotein on paclitaxel brain and brain tumor distribution in mice. Cancer Res 63(16) (2003) 5114-5117.
[8] K.K. Halder, B. Mandal, M.C. Debnath, et. al., Chloramphenicol-incorporated poly lactide-co-glycolide (PLGA) nanoparticles: formulation, characterization, technetium-99m labeling and biodistribution studies. J Drug Target 16(4) (2008) 311-320.
[9] J.M. Koziara, P.R. Lockman, D.D. Allen, R.J. Mumper, Paclitaxel nanoparticles for the potential treatment of brain tumors. J Control Release 99(2) (2004) 259-269.
[10] R.T. Liggins, H.M. Burt, Paclitaxel loaded poly(L-lactic acid) (PLLA) microspheres. II. The effect of processing parameters on microsphere morphology and drug release kinetics. Int J Pharm 281(1-2) (2004) 103-106.
[11] A. Musyanovych, J. Schmitz-Wienke, V. Mailander, et. al., Preparation of biodegradable polymer nanoparticles by miniemulsion technique and their cell interactions. Macromol Biosci 8(2) (2008) 127-139.
[12] I. Reimold, D. Domke, J. Bender, et. al., Delivery of nanoparticles to the brain detected by fluorescence microscopy. Eur J Pharm Biopharm 70(2) (2008) 627-632.
[13] W. Sun, C. Xie, H. Wang, Y. Hu, Specific role of polysorbate 80 coating on the targeting of nanoparticles to the brain. Biomaterials 25(15) (2004) 3065-3071.
[14] B. Wilson, M.K. Samanta, K. Santhi, et. al., Poly(n-butylcyanoacrylate) nanoparticles coated with polysorbate 80 for the targeted delivery of rivastigmine into the brain to treat Alzheimer's disease. Brain Res 1200 (2008) 159-168.
[15] B. Wilson, M.K. Samanta, K. Santhi, et. al., Targeted delivery of tacrine into the brain with polysorbate 80-coated poly(n-butylcyanoacrylate) nanoparticles. Eur J Pharm Biopharm 70(1) (2008) 75-84.
Рисунок 1. Цитотоксическая активность различных лекарственных форм паклитаксела против клеток Jurkat/WT
