Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии Российской академии медицинских наук;

2 ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Минздравсоцразвития России;

3 Научно-исследовательский институт атеросклероза Российской академии естественных наук, г. Москва.

Резюме

Изучена противовоспалительная активность натурального препарата антицитокинового действия «Инфламинат» на основе календулы, бузины и фиалки в модели асептического воспаления в рыхлой соединительной ткани кожи крыс, индуцированного криоповреждением. Установлено, что применение Инфламината при асептическом воспалении приводит к существенному уменьшению сроков восстановления после криоповреждения в отношении общей толщины кожи и толщины сетчатого слоя кожи, что говорит о наличии выраженного противоотечного действия Инфламината. Кроме того, применение приводит к существенному уменьшению сроков восстановления количества гематогенных и тучных клеток, что говорит об ускорении течения инфильтративной фазы воспаления.
Введение

Воспаление является универсальным патологическим процессом, течение которого является типичным при различных заболеваниях. На протяжении всего процесса в очаге воспаления происходит сосудисто-мезенхимальная реакция, которая заключается в трансформации клеток и сосудов, клеточной инфильтрации,  фагоцитозе, образовании регенеративного пролиферата и завершается дифференцировкой клеток и репарацией. Связующим звеном на всех этапах циклической воспалительной реакции является работа медиаторных систем, каскад которых запускается в процессе альтерации. Среди них особую роль играют провоспалительные цитокины, принимающие участие в каждом этапе патогенеза воспаления [1,2]. Подавление секреции цитокинов является одним из перспективных направлений противовоспалительной терапии. Современные противовоспалительные препараты обладают выраженными побочными эффектами, поэтому применение натуральных средств было бы предпочтительным для системной противовоспалительной терапии. Ранее был разработан препарат «Инфламинат» на основе календулы, бузины и фиалки, обладающий выраженным антицитокиновым эффектом, что было подтверждено в исследованиях in vitro и ex vivo [3].
Целью данной работы явилось изучение противовоспалительной активности препарата «Инфламинат» в модели асептического воспаления в рыхлой соединительной ткани кожи, индуцированного криоповреждением у крыс.

Материалы и методы

В исследовании использовали модель асептического воспаления кожи у крыс. Все эксперименты проводили на однополых белых линейных крысах Wistar (самках) весом 150-200 г в возрасте 2-4 недель, содержащихся на стандартной диете. Асептическое воспаление вызывали криоповреждением кожи площадью 6 см2 под воздействием жидкого азота.
Все крысы были разделены на 4 группы. Крысы 1-й опытной группы получали Диклофенак в дозе 50 мг один раз в сутки в течение 8 дней. Крысы 2-й опытной группы получали Инфламинат в дозе 250 мг один раз в сутки в течение 8 дней. Препараты давали из расчета 1/6 однократной дозы для человека. Препараты давали в измельченном виде в смеси с творогом. Крысы 3-й (контрольной) группы получали творог без добавления препаратов. В качестве группы сравнения использовали интактных крыс с неповрежденной кожей. В исследовании использовали 65 крыс, по 20 крыс в первых трех группах и 5 в группе сравнения.
Материал для приготовления гистологических образцов (участок кожи размером 1х2 см, параллельный позвоночнику, из поврежденного участка у подопытных крыс или аналогичный участок кожи интактных крыс) забирали в день операции и через 1, 2, 5 и 7 суток после нее. Эвтаназию животных проводили путем передозировки эфира.
Образцы ткани фиксировали метакарном (смесь метанола, хлороформа и уксусной кислоты в объемном соотношении 6:3:1) в течение суток, после чего отмывали смесью метанола и хлороформа (1:1) в течение 1 часа, затем хлороформом в течение 30 минут. Далее образцы дважды пропитывали заливочной средой (Paraplast) при 60°С в течение 2 часов. Затем проводили заливку чистым парапластом. Использовали реактивы производства Sigma Aldrich (США).
Полутонкие срезы толщиной 10 мкм готовили на микротоме (Karl Ceiss, Jena, Германия). Полученные срезы монтировали на предметные стекла и хранили при +4°С.
Перед окраской срезы депарафинизировали в спиртах восходящих концентраций. Были использованы методы одинарного иммуноцитохимического выявления различных антигенов согласно методикам Андреевой и соавт., Little и соавт. [4,5].
Окраску срезов на гематогенные клетки проводили с помощью моноклональных антител CDLC к Т- и В-лимфоцитам (Dako, США). Окраску срезов на тучные клетки проводили с помощью 0,05% раствора гистологического красителя толуидинового синего в 0,5N HCl, pH=0,5. Окраску срезов на коллаген проводили с помощью пикрофуксина. Все препараты окрашивали одновременно.
Общую толщину кожи и толщину сетчатого слоя кожи измеряли с помощью окуляр-микрометра на световом микроскопе “Jenaval” (Carlzeiss, Германия).
Общую толщину кожи и толщину сетчатого слоя кожи вычисляли по формуле: h=N x 10/15, где h – толщина кожи или сетчатого слоя кожи, N – количество делений окуляр-микрометра, соответствующее толщине кожи или сетчатого слоя кожи, 10/15 – коэффициент, учитывающий масштаб окуляр-микрометра.
Для определения количества коллагена в коже животных проводили компьютерную обработку видеоизображения гистологических препаратов с использованием программы «NIH Image» (National Institutes of Health, США). Количество коллагена оценивали в условных единицах по степени окраски пикрофуксина.
Количество положительно окрашенных  тучных и гематогенных клеток определяли на срезах на световом микроскопе “Jenaval” (Carlzeiss, Германия).
Статистическую оценку результатов исследования проводили с использованием пакета статистических программ SPSS (SPSS Corporation, версия 10.0, США).

Результаты

Было установлено, что в результате криоповреждения у всех животных немедленно увеличивалась толщина кожи, в среднем в 3,9 раза (p<0,001). Толщина кожи у крыс в двух опытных группах, принимавших Инфламинат и Диклофенак, уже в первые сутки после криоповреждения достоверно уменьшалась, что составляло соответственно 83,8±17,0 мкм (p<0,05) и 96,0±12,4 мкм (p<0,05) по сравнению с 143,7±39,8 мкм в контрольной группе. Через двое суток после криоповреждения толщина кожи в опытных группах достигала исходных величин и достоверно отличалась от контрольной группы, p<0,05 (Таблица 1). В контрольной группе толщина кожи уменьшалась до исходной величины только к 5 дню после криоповреждения.
Толщина кожи сразу после операции увеличивалась в основном за счет сетчатого слоя. Сразу после криоповреждения у всех животных статистически значимо увеличивалась толщина сетчатого слоя кожи, в среднем в 12 раз (p<0,001). В первые сутки после операции толщина сетчатого слоя кожи у крыс в двух опытных группах, принимавших Инфламинат и Диклофенак, стала достоверно меньше, чем в контрольной группе. Через 5 дней толщина сетчатого слоя кожи в группе, принимавшей Инфламинат, достигала исходных величин и достоверно отличалась от контрольной группы и группы, принимавшей Диклофенак (Таблица 2).

 

Таблица 1. Влияние препаратов Инфламинат и Диклофенак на толщину кожи крыс.

	День эксперимента
	До операции	0	1	2	5	7
Группа	Толщина кожи, мкм
Интактные крысы	68±3
1-я группа (Диклофенак)		265±9 *	96±12 *#$	76±17 #	72±9 #	66±2 #
2-я группа (Инфламинат)		265±10 *	84±17 *#$	77±15 #	63±6 #	65±4 #
3-я группа (контроль)		265±8 *	144±39 *#	94±10 *#	74±9 #	65±8 #

* - достоверное отличие показателей от интактных животных, p<0,05:

^# - достоверное уменьшение толщины кожи по сравнению с состоянием после операции, p<0,05;

^$ - достоверное отличие от показателей динамики изменений в контрольной группе, p<0,05.

    Содержание коллагена в области криоповреждения изменялось в одинаковой степени как в контрольной, так и в опытных группах (данные не представлены).
Было установлено, что в первые сутки после криоповреждения у всех животных количество положительно окрашенных тучных клеток существенно уменьшилось. При этом у животных, принимавших Диклофенак, количество положительно окрашенных тучных клеток было достоверно ниже, чем в контрольной группе и в группе, получавшей Инфламинат, что составляло соответственно 2138±821 кл./мм2 (p<0.05), 6417±419 кл./мм2 (p<0.05) и 6417±419 кл./мм2 (p<0.05). Уже на 5 день количество положительно окрашенных  тучных клеток в группе животных, принимавших Диклофенак, было достоверно выше, чем в контрольной группе и группе, принимавшей Инфламинат, что составляло соответственно 7333±1552 кл./мм2 (p<0.05), 4891±145 кл./мм2 (p<0.05) и 4657±1083 кл./мм2 (p<0.05). Через семь суток после криоповреждения количество положительно окрашенных тучных клеток в двух опытных группах достигало исходных величин и достоверно отличалось от контрольной группы, p<0,05 (Таблица 3).

Таблица 2. Влияние препаратов Инфламинат и Диклофенак на толщину сетчатого слоя кожи крыс (n=65).

	День эксперимента
	До операции	0	1	2	5	7
Группа	Толщина сетчатого слоя кожи, мкм
Интактные крысы	15±4
1-я группа (Диклофенак)		190±10 *	44±5 *#$	23±9 *#	21±5 *#	14±3 #
2-я группа (Инфламинат)		190±10 *	35±10 *#$	25±6 *#	15±2 #$	16±3 #
3-я группа  (контроль)		190±10 *	89±37 *#	38±9 *#	27±7 *#	19±6 #

 

* - достоверное отличие показателей от интактных животных, p<0,05:

^# - достоверное уменьшение толщины кожи по сравнению с состоянием после операции, p<0,05;

^$ - достоверное отличие от показателей динамики изменений в контрольной группе, p<0,05.

В первые сутки после операции у всех животных резко увеличилось количество гематогенных клеток. Через 2 дня после криоповреждения количество гематогенных клеток у крыс в двух опытных группах, принимавших Инфламинат и Диклофенак, достигала исходных величин, что составляло соответственно 13325±1318 кл./мм2 (p<0.05), 10467±689 кл./мм2 (p<0.05), по сравнению с контрольной группой 30672±4594 кл./мм2 (p<0.05) (Таблица 4).

Таблица 3. Влияние препаратов Инфламинат и Диклофенак на количество положительно окрашенных тучных клеток в коже крыс.

	День эксперимента
	До операции	0	1	2	5	7
Группа	количество тучных клеток, 103/мм2люминальной поверхности
Интактные крысы	11,0±0,7
1-я группа (Диклофенак)		10,3±0,5	2,1±0,8 *#	4,6±0,5 *	7,3±1,6 *$	10,5±1,6$
2-я группа (Инфламинат)		10,3±0,5	5,0±0,2 *	2,4±0,8 *#	4, 7±1,1 *	11,3±1, 8$
3-я группа (контроль)		10,3±0,5	6,4±0,4 *	3,8±0,3 *	4,9±0,1 *	7,6±0,5

 

* - достоверное отличие показателей от интактных животных, p<0,05:

^$ - достоверное увеличение количества положительно окрашенных тучных клеток от показателей динамики изменений в контрольной группе, p<0,05.

^# - достоверное уменьшение количества положительно окрашенных тучных клеток от показателей динамики изменений в контрольной группе, p<0,05.

Таким образом, в условиях асептического воспаления толщина кожи при криоповреждении существенно увеличивалась. Применение Инфламината уже в первый день после криоповреждения приводило к достоверному уменьшению отека, а в последующие дни – к полному устранению отека. Применение Диклофенака также приводило к уменьшению отека уже в первый день после криоповреждения, и к полному устранению отека в последующие дни. Достоверных различий в противоотечном действии Диклофенака и Инфламината выявлено не было (p=0,869).
Сходные результаты получены и при сравнительном анализе динамики изменений толщины сетчатого слоя кожи при асептическом воспалении. Применение Инфламината в первый и второй день после криоповреждения приводило к достоверному уменьшению отека сетчатого слоя, а в последующие дни – к полному устранению отека. Применение Диклофенака дало сходные результаты, и достоверных различий в противоотечном действии Диклофенака и Инфламината на уровне сетчатого слоя кожи выявлено не было (p=0,904).

Таблица 4. Влияние препаратов Инфламинат и Диклофенак на количество гематогенных клеток в коже крыс.

	День эксперимента
	До операции	0	1	2	5	7
Группа	количество гематогенных клеток, 103/мм2люминальной поверхности
Интактные крысы	13,8±1,2
1-я группа (Диклофенак)		14,3±1,4	63,1±3,4 *	10,5±6,9 $	10,9±7,6	10,4±1,11
2-я группа (Инфламинат)		14,3±1,4	66,4±5,7 *	13,3±1,3 $	13,1±1,0	14,3±2,5
3-я группа (контроль)		14,3±1,4	64,6±2,6 *	30,7±4,6 *	16,3±3,0	12,5±1,1

* - достоверное отличие показателей от интактных животных, p<0,05:

^$ - достоверное уменьшение количества гематогенных клеток от показателей динамики изменений в контрольной группе, p<0,05.

Ни Инфламинат, ни Диклофенак не влияли на синтез и содержание коллагена в сетчатом слое кожи после криоповреждения. По всей видимости, содержание коллагена в коже – стабильный показатель, не изменяющийся в условиях асептического воспаления при криотравме.
Криоповреждение не вызывает интенсивной дегрануляции тучных клеток непосредственно после нанесения холодовой травмы. Напротив, на следующий день после операции количество положительно окрашенных тучных клеток резко снижается. Таким образом, этот показатель характеризует течение инфильтративной фазы воспаления. В условиях применения Инфламината в первый и второй день после криоповреждения количество положительно окрашенных тучных клеток снизилось, но эффективность Диклофенака была выше (p=0,039 и p=0,045, соответственно). На пятый и седьмой день после криоповреждения различия между группами были недостоверными (p=0,215 и p=0,798, соответственно). Таким образом, противовоспалительное действие Инфламината развивается медленнее, чем при приеме Диклофенака, и достигает максимума на второй, а не на первый день. Тем не менее, по глубине противовоспалительного действия препараты не различаются, и полное восстановление пула положительно окрашенных тучных клеток происходит в одинаковые сроки.
Криоповреждение не вызывает увеличения содержания гематогенных клеток в коже непосредственно после нанесения холодовой травмы. Напротив, на следующий день после операции количество гематогенных клеток резко повышается. Таким образом, этот показатель также характеризует течение инфильтративной фазы воспаления. В первый день после криоповреждения ни Инфламинат, ни Диклофенак не препятствуют инфильтрации пораженной кожи гематогенными клетками. Оба препарата в равной степени останавливают инфильтрацию пораженной кожи гематогенными клетками уже на второй день после операции, то есть резко обрывают инфильтративную стадию воспаления, при этом различия между противовоспалительным действием двух препаратов недостоверны (р=0,793).

Обсуждение

В данном исследовании было установлено, что применение Инфламината при асептическом воспалении приводит к существенному уменьшению сроков восстановления после криоповреждения в отношении общей толщины кожи и толщины сетчатого слоя кожи, что говорит о наличии выраженного противоотечного действия Инфламината. Кроме того, применение приводит к существенному уменьшению сроков восстановления количества гематогенных и тучных клеток, что говорит об ускорении течения инфильтративной фазы воспаления.
В недавнем исследовании антицитокиновой активности натурального препарата Инфламинат в модели ex vivo было выявлено, что его эффект сравним с действием нестероидного противовоспалительного препарата Диклофенак  [3]. В данном исследовании на животной модели было показано, что Инфламинат обладает противовоспалительным действием, сравнимым с эффективностью Диклофенака. Вероятно, механизм противовоспалительного действия Инфламината заключается в подавлении секреции провоспалительных цитокинов. В настоящее время большое количество исследований посвящено изучению роли цитокинового звена в патогенезе различных заболеваний, особенно хронических. Это связано с несовершенством терапевтической тактики и поиском новых подходов к лечению этих заболеваний. Так, изучается роль различных цитокинов в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний [6,7], ревматических болезней [8], астмы [9], необластических процессов [10,11] и т.п. Существуют эффективные схемы антицитокиновой терапии в лечении ревматоидного артрита [12]. Известно о плейотропном действии статинов, возможно, их эффективность при атеросклерозе в определенной мере осуществляется за счет подавления цитокинового звена воспаления [13]. C другой стороны, препараты жирных кислот, обладающие антицитокиновой активностью в животной модели, оказались неэффективными при клинических испытаниях [14].
Натуральный препарат Инфламинат с антицитокиновым действием может оказаться эффективным средством для длительной противовоспалительной терапии. Для подтверждения этого предположения требуется клиническое исследование его эффективности.

Список литературы

1.    Серов В.В., Пауков В.С. Воспаление. Руководство для врачей. М.: Медицина,1995.
2.    Whicher J.T., Evans S.W. Cytokines in disease. // Clin. Chem. 1990.-Vol.36.-pp.1269-1281
3.    Горчакова Т.В., Супрун И.В., Собенин И.А., Орехов А.Н. Применение натуральных продуктов в антицитокиновой терапии. // Бюлл. эксперим. биол. мед. 2007.-T.143.-№3.-c.284-288.
4.    Andreeva E.R., Pugach I.M., Orekhov A.N. Subendothelial smooth muscle cells of human aorta express macrophage antigen in situ and in vitro. // Atherosclerosis. 1997.-Vol.135.-pp.19-27.
5.     Little T.L., Beyer E.C., Duling B.R. Connexin 43 and connexin 40 gap junctional proteins are present in arteriolar smooth muscle and endothelium in vivo. // Am. J. Physiol. 1995.-Vol.268.-pp.H729-H739.
6.    Kleemann R., Zadelaar S., Kooistra T. Cytokines and atherosclerosis: a comprehensive review of studies in mice. // Cardiovasc. Res. 2008.-Vol.79.-pp.360-376.
7.    Nian M., Lee P., Khaper N., Liu P. Inflammatory cytokines and postmyokardial infarction remodeling. // Circ. Res. 2004.-Vol.94.-pp.1543-1553.
8.    Paunovic V., Carroll H.P., Vandenbroeck K., Gadina M. Signalling, inflammation and arthritis: Crossed signals: the role of interleukin (IL)-12, -17, -23 and -27 in autoimmunity. // Rheumatology. 2008.-Vol.47.-pp.771-776.
9.    Chung K.F., Barnes P.J. Cytokines in asthma. // Thorax. 1999.-Vol.54.-pp.825-857.
10.    Lu H., Ouyang W., Huang C. Inflammation, a key event in cancer development. // Mol. Cancer Res. 2006.-Vol.4.-pp.221-233.
11.    Budhu A., Wang H.W. The role of cytokines in hepatocellular carcinoma. // J. Leukocyte Biol. 2006.-Vol.80.-pp.1197-1213.
12.    Doan T., Massarotti E. Rheumatoid Arthritis: An overview of new and emerging therapies. // J. Clin. Pharmacol. 2005.-Vol.45.-pp.751-762. 
13.    Paoletti R., Gotto A., Hajjar D. Inflammation in atherosclerosis and implications for therapy. // Circulation. 2004.-Vol.109.-pp.20-26.
14.    Blok W.L., Katan M.B., van der Meer J.W.M. Modulation of inflammation and cytokine production by dietary (n-3) fatty acids. // J. .Nutr. 1996.-Vol.126.-pp.1515-1533.