1    Московский физико-технический институт (государственный университет) (г. Москва);
2    НИИ атеросклероза РАЕН (г. Москва);
3    НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН (г. Москва);
4    Московский государственный университет им. Ломоносова (г. Москва).

РЕЗЮМЕ
Эффективная стимуляция иммунитета больного со скрытой иммунопатологией способна существенно повысить эффективность традиционной терапии и улучшить профилактику самых разнообразных заболеваний. Целью настоящего исследования является разработка тест-системы, позволяющей определять профиль активации моноцитов, а также изучение чувствительности тест-системы в отношении дексаметазона и аминотиолярного медьсодержащего комплекса (АМК), способных влиять на процессы активации моноцитов. Было доказано, что разработанная методика  позволяет регистрировать активацию моноцитов по обоим направлениям. Было выявлено, что дексаметазон препятствует провоспалительной активации и стимулирует противовоспалительную активацию; АМК не оказывает заметного влияния на провоспалительную активацию, однако, препятствует противовоспалительной. Разработанная тест-система позволяет проводить количественную оценку модулирующего влияния различных веществ на профиль активации моноцитов, и может быть использована как инструмент для разработки новых противовоспалительных препаратов.

 
ВВЕДЕНИЕ
Развитие клеточной биологии и биомедицины позволяет проводить большое число исследований влияния различных веществ на организм человека в моделях in vitro и ex vivo. Современные методы исследований открывают широкие возможности для определения механизмов работы регуляторных систем клеток человека, а так же позволяют выявлять некоторые особенности у отдельных индивидов. Однако, не во всех областях биологии и медицины существуют эффективные и простые тест-системы для исследований, связанных с повышением качества и продолжительности жизни. Например, вклад сердечно-сосудистых заболеваний в структуру смертности составлял 56% (около 15% - атеросклероз) по данным за 2007 год, что не может не отразиться на средней продолжительности жизни – 58,9 лет (для мужчин), в то время как в Японии этот показатель значительно выше – 87 лет. [1] Поэтому значительно важной задачей является разработка различных тест-систем для определения у пациентов предрасположенности к сердечнососудистым заболеваниям, выявления заболеваний на всех стадиях, определения иммунного статуса отдельных пациентов, а также позволяющих исследовать влияние различных веществ на воспалительные процессы. Разработке одной из таких тест-систем посвящена данная работа.
Воспалительные процессы сопровождаются активацией клеток, циркуляцией активированных Т-клеток, продуцирующих цитокины, характерные для той или иной локализации воспаления. Моноциты играют важную роль в процессе воспаления, являясь предшественниками антигенпрезентирующих клеток. При воспалительном заболевании активация макрофагов происходит уже в кровотоке. Разрабатываемая тест-система направлена на определение активации моноцитов по про- и противовоспалительному направлениям, а также оценку противовоспалительной активности некоторых веществ (дексаметазон, АМК).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Первичные человеческие моноциты получали из периферической крови (для проведения опытов по изучению способности моноцитов реагировать на стимулирование воспалительным или противовоспалительным цитокинами и по исследованию влияния дексаметазона и АМК на активацию моноцитов) или из лейкоцитарной пленки (для проведения опытов по исследованию эффективности различных методов получения моноцитов и по определению активации моноцитов в процессе выделения) здоровых доноров в возрасте от 25 до 60 лет. В качестве антикоагулянта использовали раствор цитрата натрия. Кровь разделяли на подушке Фикола для получения лейкоцитарной фракции, после чего проводили дополнительное центрифугирование полученной клеточной суспензии в градиенте Перкола. В результате получали клеточную популяцию, содержащую от 40 до 70% моноцитов. Для получения чистой популяции моноцитов проводили магнитную сепарацию положительных к кластеру дифференцировки 14 (CD14+) клеток с использованием парамагнитных наночастиц, конъюгированных с антителами к CD14. Этот подход позволял получать клеточную популяцию, содержащую не менее 97% моноцитов, что считалось достаточной для дальнейшего исследования чистотой.
Полученные клетки ресуспендировали в концентрации 106 клеток/мл в среде «X-vivo 10». Полученную суспензию клеток распределяли в 24-луночный планшет из расчета 2х105 клеток на лунку.
Для стимуляции клеток с целью активации по провоспалительному фенотипу в среду добавляли интерферон-гамма (ИФН-гамма) в конечной концентрации 100 нг/мл. Для стимуляции клеток с целью активации по противовоспалительному фенотипу в среду добавляли интерлейкин-4 (ИЛ-4) в конечной концентрации 10 нг/мл. Для оценки противовоспалительного эффекта исследуемых модуляторов клеточного ответа последние добавляли к опытным культурам клеток в соответствующих концентрациях, указанных в разделе «Результаты». Инкубацию клеток осуществляли в течение 72 часов при 37°С в насыщенной парами воды атмосфере в СО2 инкубаторе (95% атмосферного воздуха, 5% углекислого газа) без смены среды. По окончании инкубации планшеты центрифугировали в специальных адаптерах на центрифуге Beckman TJ-6 в течение 15 мин при 1800 g для осаждения плавающих клеток. Культуральную среду (надосадочную жидкость) отбирали в чистые 48-луночные планшеты и хранили при -20ºС до измерения концентрации секретированных цитокинов. Клетки  лизировали в 250 мкл 0,01% раствора Тритона X-100 в воде в течение 30 мин при комнатной температуре и хранили при -20ºС до измерения концентрации внутриклеточных цитокинов.
Содержание клеточного белка определяли в аликвотах лизатов клеток по методу Лоури. Результаты измерения клеточного белка использовали для нормирования продукции и секреции цитокинов.
Измеряли продукцию следующих цитокинов: фактор некроза опухоли-альфа (ФНО-альфа), CC хемокин 18 (CCL18), ИЛ-1-бета, антагонист рецептора интерлейкина-1 (ИЛ-1ра) (набор измеряемых параметров варьировал в зависимости от типа эксперимента). Для измерения концентраций цитокинов, произведенных макрофагами, использовали метод твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).
Статистическую обработку проводили с использованием пакета SPSS (SPSS Inc., США). Достоверными считали различия при 95% вероятности безошибочного прогноза.

РЕЗУЛЬТАТЫ
Исследование эффективности различных методов выделения моноцитов из крови человека.
На начальном этапе разработки тест-системы была исследована чистота получаемой клеточной популяции. Для выделения моноцитов использовали  четыре различных метода: центрифугирование на подушке Фикола с последующим центрифугированием в градиенте Перкола; центрифугирование на подушке Фикола с последующим разделением клеток при помощи клеточной адгезии; центрифугирование на подушке Фикола с последующим центрифугированием в градиенте Перкола и выделением CD14 положительных клеток при помощи магнитных частиц; центрифугирование на подушке Фикола с последующим выделением CD14 положительных клеток при помощи магнитных частиц.
Так как для эффективного функционирования разрабатываемой тест системы требуется не менее 90% СD14 положительных клеток в получаемой клеточной популяции, то методы центрифугирования в градиенте Фикола и Перкола и центрифугирования в градиенте Фикола с последующей адгезией не были использованы для дальнейшего анализа. Метод последовательного центрифугирования в градиентах Фикола и Перкола с последующей магнитной сепарацией CD14 положительных клеток показал приемлемый результат, однако, плохо применим для клинических исследований, так как требует больших количеств исходного материала при использовании периферической крови в качестве исходного материала; потери клеток в результате 2-х центрифугирований в градиенте плотности оказались неприемлемо высоки.
Таким образом, в окончательном варианте для выделения моноцитов из лейкоцитарной пленки использовали метод центрифугирования на подушке Фикола с последующим центрифугированием в градиенте Перкола и выделением CD14 положительных клеток при помощи магнитных частиц, а из периферической крови - метод центрифугирования в градиенте Фикола  с последующей магнитной сепарацией.
Исследование продукции про- и противовоспалительных цитокинов как маркеров активации моноцитов в процессе выделения
Следующим этапом разработки тест-системы было исследование влияния процессов выделения моноцитов на  активацию клеток по про- или противовоспалительному фенотипу. Для этого после выделения и культивирования клеток в течение 72-х часов отбирали культуральную среду и определяли концентрации следующих цитокинов: ИЛ-1 и ФНО-альфа (маркеры провоспалительной активации), CCL-18 и ИЛ-1ра (маркеры противовоспалительной активации).
Измерения показали, что при отсутствии стимуляции культивируемые макрофаги не производили ни один из вышеупомянутых цитокинов. При этом легко детектируемые концентрации соответствующих цитокинов определялись в пробах, подготовленных в качестве положительного контроля. На этом основании можно заключить, что разработанная методика выделения первичных моноцитов периферической крови не приводит к активации макрофагов по про- или противовоспалительному направлениям.
Изучение способности моноцитов реагировать на стимулирование воспалительным цитокином интерфероном-гамма или противовоспалительным цитокином интерлейкином-4.
Для последующей отработки тест-системы была исследована способность моноцитов реагировать на добавляемые в культуральную среду следующие цитокины: ИФН-гамма (провоспалительный цитокин) и ИЛ-4 (противовоспалительный цитокин). Для этого, так же как и на предыдущем этапе, после выделения, добавления ИФН-гамма или ИЛ-4 и культивирования клеток в течение 72-х часов отбирали культуральную среду и определяли концентрации следующих цитокинов: ИЛ-1-бета  и ФНО-альфа (как маркеры провоспалительной активации; определялись после добавления к клеткам ИФН-гамма), CCL-18 и ИЛ-1ра (как маркеры противовоспалительной активации; определялись после добавления к клеткам ИЛ-4).
Частоты значений концентраций цитокинов ИЛ-1-бета, ФНО-а, CCL-18 и ИЛ-1ра в культуральной жидкости макрофагов представлены на Рисунке 1.  Распределения значений концентраций цитокинов позволяют заключить, что разработанная методика позволяет использовать получаемые первичные моноциты периферической крови для исследования их способности адекватно реагировать на про- и противовоспалительные стимулы.

Исследование модулирующего действия дексаметазона и аминотиолярного медьсодержащего комплекса (АМК) на профиль активации моноцитов.
Последним этапом разработки тест-системы было исследование способности методики характеризовать действие различных веществ на профиль активации моноцитов. Для этого в культуральную среду добавляли дексаметазон или АМК.
Для исследования влияния дексаметазона проводили контрольные измерения цитокинов ФНО-альфа или CCL-18, добавляя к клеткам ИФН-гамма или ИЛ-4 соответственно (Таблица 1А, Контроль),  и основные измерения концентраций цитокинов ФНО-альфа или CCL-18, добавляя к клеткам сначала ИФН-гамма или ИЛ-4 соответственно, а затем дексаметазон в концентрации 10-7 моль/л (Таблица 1А, Дексаметазон). Клетки инкубировали в течение 72-х часов. Результаты измерений представлены в Таблице 1А, из которых следует, что дексаметазон существенным образом подавлял индуцированную ИФН-гамма секрецию ФНО-альфа, то есть оказывал выраженное влияние на процессы провоспалительной активации моноцитов. В тоже время дексаметазон существенным образом стимулировал индуцированную ИЛ-4 секрецию CCL-18, то есть стимулировал активацию моноцитов по противовоспалительному фенотипу.

 

ОБСУЖДЕНИЕ
В данной работе проводили разработку тест-системы для определения способности моноцитов крови человека к активации по провоспалительному и противовоспалительному фенотипам. На начальном этапе были выявлены наиболее эффективные способы выделения моноцитов: последовательное центрифугирование в градиентах плотности Фикола и Перкола с последующей магнитной сепарацией CD14 положительных клеток (при выделении из лейкоцитарной пленки) и аналогичная методика с однократным центрифугированием на подушке Фикола (при выделении из периферической крови). Магнитная сепарация активно используется для получения культуры клеток высокой чистоты (более 90%), данная методика проста в исполнении. Нами и другими исследователями было доказано, что данные методы выделения высокоэффективны и не вызывают активации моноцитов. [2-4]
Следующим этапом работы было проведение активации моноцитов по про- и противовоспалительному фенотипам.  Активация производилась путем добавления к клеткам ИЛ-4 или ИФН-гамма, данный способ активации считается общепринятым. [3-5] Для количественно описания активации моноцитов измеряли концентрации цитокинов ФНО-альфа, ИЛ-1-бета, как маркеров активации по провоспалительному [5,6] и CCL-18, ИЛ-1-ра, как маркеров активации по противоспалительному [5,7,8,9] фенотипам. Представленные на Рисунке 1 частоты концентраций цитокинов демонстрируют, что разработанная тест-система позволяет регистрировать активацию моноцитов по обоим направлениям.
 Заключительным этапом было применение методики для исследования влияния дексаметазона и АМК на профиль активации моноцитов. Как известно, дексаметазон обладает противовоспалительным действием и оказывает влияние на все этапы воспалительного процесса, например, ингибирует синтез простагландинов на уровне арахидоновой кислоты, синтез провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ФНО-альфа и др.), а также повышает устойчивость клеточной мембраны к действию различных повреждающих факторов [10-12]. АМК является цитостатиком, обладающим иммуносупрессивными свойствами, что приводит снижению выделения макрофагами ИЛ-1, ИЛ-2, ИФН-гамма и образования антител. Было выявлено, что дексаметазон препятствует провоспалительной активации и стимулирует противовоспалительную активацию; АМК не оказывает заметного влияния на провоспалительную активацию, однако, препятствует противовоспалительной, что не противоречит известным свойствам этих веществ.
Результаты данной работы позволяют заключить, что разработанная тест-система позволяет проводить количественную оценку модулирующего влияния различных веществ на профиль активации моноцитов. Тест-система может быть использована как инструмент для скрининга веществ и соединений с целью разработки новых противовоспалительных средств.

Работа проводилась при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1.    Демографический ежегодник России. Федеральная служба государственной статистики, М., 2008, 557 стр.
2.    Oude Engberink RD, van der Pol SM, Döpp EA, de Vries HE, Blezer EL. Comparison of SPIO and USPIO for in vitro labeling of human monocytes: MR detection and cell function. //  Radiology.-2007.- Vol.243.-no.2.-pp.467-474.
3.    Kzhyshkowska J, Mamidi S, Gratchev A, Kremmer E, Schmuttermaier C, Krusell L, Haus G, Utikal J, Schledzewski K, Scholtze J, Goerdt S. Novel stabilin-1 interacting chitinase-like protein (SI-CLP) is up-regulated in alternatively activated macrophages and secreted via lysosomal pathway. // Blood.-2006.-Vol.107.-no.8.-pp.107-108.
4.    Gratchev A, Schmuttermaier C, Mamidi S, Gooi L, Goerdt S, Kzhyshkowska J. Expression of Osteoarthritis Marker YKL-39 is Stimulated by Transforming Growth Factor Beta (TGF-beta) and IL-4 in Differentiating Macrophages. // Biomark Insights.-2008.-Vol.3.-pp.39-44.
5.    de Waal Malefyt R, Figdor CG, Huijbens R, Mohan-Peterson S, Bennett B, Culpepper J, Dang W, Zurawski G, de Vries JE. Effects of IL-13 on phenotype, cytokine production, and cytotoxic function of human monocytes. Comparison with IL-4 and modulation by IFN-gamma or IL-10. //  J Immunol.-1993.-Vol.151.-no.11.-pp.6370-6381.
6.    Ferraz N, Hong J, Santin M, Karlsson Ott M. Nanoporosity of alumina surfaces induces different patterns of activation in adhering monocytes/macrophages. // Int J Biomater.-2010.-Dec 28.-Epub.
7.    Buechler C, Ritter M, Orsó E, Langmann T, Klucken J, Schmitz G. Regulation of scavenger receptor CD163 expression in human monocytes and macrophages by pro- and antiinflammatory stimuli. // J Leukoc Biol.-2000.-Vol.67.-no.1.-pp.97-103.
8.    Porcheray F, Viaud S, Rimaniol AC, Léone C, Samah B, Dereuddre-Bosquet N, Dormont D, Gras G. Macrophage activation switching: an asset for the resolution of inflammation. // Clin Exp Immunol.-2005.-Vol.142.-no.3.-pp.481-489.
9.    Scotton CJ, Martinez FO, Smelt MJ, Sironi M, Locati M, Mantovani A, Sozzani S. Transcriptional profiling reveals complex regulation of the monocyte IL-1 beta system by IL-13. // J Immunol.-2005.-Vol.74.-no.2.-pp.834-845.
10.    London NJ, Chiang A, Haller JA. The dexamethasone drug delivery system: Indications and evidence. // Adv Ther.-2011.-Mar 12.- Epub ahead of print.
11.    Menge C, Dean-Nystrom EA. Dexamethasone depletes gammadelta T cells and alters the activation state and responsiveness of bovine peripheral blood lymphocyte subpopulations. // J Dairy Sci.-2008.-Vol.91.-no.6.-pp.2284-2298.
12.    Guerrero JA, Vicente V, Corral J. Dexamethasone induction of a heat stress response. // Methods Enzymol.-2011.-Vol.490.-pp.121-135.