Эта работа опубликована в сборнике статей по материалам 70-й Юбилейной итоговой научной студенческой конференции им. Н.И. Пирогова (г. Томск, 16-18 мая 2011 г.), под ред. В. В. Новицкого, Л. М. Огородовой. − Томск: Сибирский государственный медицинский университет, 2011. − 430 с.

 

Скачать сборник (формат MS Word, 7,3 мб)

Посмотреть основную информацию о сборнике, обложку и т.д.

 

Актуальность: атеросклероз и его осложнения занимают одно из лидирующих мест в структуре заболеваемости и смертности в большинстве стран мира, в том числе и в России. В отличие от канцерогенеза, в основе развития которого значительную роль играют структурные нарушения генома, полагают, что атерогенез, в большей степени, связан с изменением функциональной активности генов [1]. Эпигенетические механизмы, которые регулируют структуру хромосом и экспрессию генов, включают несколько уровней организации. В частности, метилирование по остаткам цитозина в молекуле ДНК, предшествующим гуанозину (CpG-сайты), является наиболее изученным феноменом. Недавно была показана надежная ассоциация локуса 9p21.3 с риском развития заболеваний, входящих в сердечно-сосудистый континуум [2]. Однонуклеотидные полиморфизмы, связанные с патологией, тесно сцеплены и расположены недалеко от генов ингибиторов циклин-зависимых киназ, в частности CDKN2A (кодирует прототипы INK4 белка p^16INK4a и p^14ARF с альтернативным сплайсингом). Не исключено, что эпигенетические механизмы задействованы в регуляции экспрессии данного гена и могут вносить вклад в формирование предрасположенности к атеросклерозу.

Цель: оценка статуса метилирования промоторного региона гена CDKN2A, кодирующего белок клеточного цикла (p^16INK4A), в тканях атеросклеротических бляшек и макроскопически неизмененных стенок сонных артерий у индивидов-носителей разных генотипов полиморфного варианта rs1333045:C>T, локализованного в локусе 9p21.3.

Материалы и методы: в группу обследования вошли 54 русских мужчины (возраст 49-79 лет). Из них 44%, 35% и 63% имели в анамнезе инфаркт миокарда и/или инсульт или транзиторные ишемические атаки и/или заболевания периферических вен, соответственно. В результате оперативных вмешательств по эндартерэктомии сонной артерии был создан банк тканей сосудистой стенки. Выделение ДНК проводилось методом фенол-хлороформной экстракции. При анализе генотипов полиморфизма rs1333045:C>T проводили амплификацию фрагментов ДНК, выделенной из лейкоцитов периферической крови, при помощи метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Продукты реакции подвергали обработке рестриктазой MvaI, разделяли в 3% агарозном геле с последующей детекцией фрагментов при помощи бромистого этидия в проходящем ультрафиолетовом свете. Оценка статуса метилирования гена CDKN2A проводилась методом метилчувствительной ПЦР с использованием ДНК, выделенной из тканей сонных артерий. Суть метода состоит в инкубации анализируемой ДНК с метилчувствительной рестриктазой HpaII (Fermentas, Литва), которая узнает сайты ССGG и не гидролизует их в случае метилирования цитозина, затем продукты реакции амплифицируются, разделяются в геле и детектируются подобно тому, как это описано ранее. Исследуемый регион содержит 50 СpG-сайтов, 3 из которых узнаются рестриктазой. Статистическую обработку результатов исследования проводили с помощью программного пакета SPSS for Windows (SPSS Inc). Для сравнения частот генотипов и аллелей был использован критерий χ² Пирсона.

Результаты: наблюдаемое распределение частот генотипов по исследуемому молекулярному варианту соответствовало ожидаемым при равновесии Харди-Вайнберга и составило 31,5%; 44,4% и 24,1% для генотипов СС, CT и TT соответственно. Частоты аллелей С и Т были равны 53,7% и 46,3% соответственно. Частота редкого варианта в нашем исследовании оказалась на 14% ниже таковой (р<0,05) среди больных коронарным атеросклерозом в популяции Канады [3]. Кроме того, согласно данным NCBI частота аллеля Т в североамериканской популяции довольно высока и в некоторых исследованиях достигает 70,8%. С другой стороны, результаты нашего исследования не отличались от распределения частот аллелей в восточноазиатской популяции (р=0,351), в которой они составили 60% и 40% для аллелей С и Т, соответственно.

Эпигенетическая вариабельность локусов, вовлеченных в атерогенез, остается относительно малоизученной. В настоящее время оценка статуса метилирования в атеросклеротических бляшках in vivo была проведена лишь для четырех генов: ESRA, ESRB, MCT3 и TFPI. По результатам настоящего исследования аберрантного метилирования промоторного региона гена p16INK4A в тканях из области атеросклеротических бляшек и макроскопически неизмененной сосудистой стенки сонной артерии не выявлено. Поскольку существует зависимость между снижением плотности метилирования в CpG-островках и функциональной активностью гена, эти данные согласуются с таковыми в отношении исследования экспрессии. В частности, ранее было показано, что p^16INK4a экспрессируется макрофагами, пенистыми клетками и гладкомышечными клетками во всех трех слоях в области атеросклеротических бляшек и морфологически неизмененной сосудистой стенки коронарных артерий [4].

Выводы: проведенное исследование не выявило аберрантного метилирования ни в морфологически неизмененных тканях, ни в атеросклеротических бляшках сонных артерий среди носителей различных генотипов полиморфного варианта rs133045 локуса 9р21.3.