Харьковский Биотехнологический Центр Украинской Академии Аграрных Наук, Украина

Эта работа опубликована в сборнике научных трудов «Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии» (2004 год, выпуск 1), под редакцией проф., д.м.н. Ильинских Н.Н. Посмотреть титульный лист сборника

В обзоре рассматривается систама молекулярных эффекторов апоптоза. Представлены данные о каскадной организации ее функционирования и аспекты возможной систематизации ее компонентов. Сделаны выводы о возможном приминении разрабатываемой молекулярной модели апоптоза.

Апоптоз – это запограммированная генетически гибель клеток, которая является весьма распространенным общебиологическим феноменом (элементы его наблюдаются даже у некоторых одноклеточных) [1]. Апоптоз имеет место на всех этапах онтогенеза, причем выполняя часто одну из ключевых ролей. Морфогенез структур организма, элиминация поврежденных, “отработанных” и нефункциональных клеток, противовирусная и противоопухолевая защита – вот перечень лишь наиболее основных сфер деятельности апоптоза. Поэтому и неудивительно, что масштаб и темп современных исследований данной проблемы в научном мире постоянно возрастают. Область применения разработок по запрограммированной гибели клеток (ЗГК) также очень обширна. На сегодняшний день достаточно актуальным вопросом является построение молекулярной модели апоптоза, т.к. понимание тонких механизмов этого процесса и функциональной иерархии его компонентов чрезвычайно важно для разработок препаратов, которые бы направлено модулировали ЗГК и балансировали ее дерегуляцию, являющуюся причиной огромного числа патологий [2].
Целью настоящий работы является обзор обнаруженных на сегодняшний день молекулярных компонентов эффекторного звена апоптоза, их биохимических свойств и расположения в системной иерархии.
Типы и фазы апоптоза. Вначале кратко охарактеризуем апоптотический процесс в целом. Основной биологический смысл апоптоза состоит в поддержании тканевого гомеостаза. Апоптоз является противоположным пролиферации процессом и направленно элиминирует клетки, которые должны исчезнуть из целостной биосистемы по тем или иным причинам.
На молекулярном уровне механизм регуляции апоптоза имеет двустороннюю схему. С одной стороны, апоптотическая машина запускается внутриклеточным сигналингом из системы чекпойнта (в случае детекции нерепарируемых повреждений генома) [3]. С другой стороны, апоптоз индуцируется внеклеточными триггерами -  киллерными лигандами - из системы морфогенеза или иммунной системы (в случае нормальной инволюции или инструктивного апоптоза) [4, 5]; данный момент предполагает презентацию специфических рецепторов на поверхности клетки [5].
Условно ЗГК можно разделить на два типа: 1) физиологический апоптоз – это процесс удаления определенной клеточной популяции в ходе нормального развития (нормальная инволюция, необходимая для формирования архитектуры органов); 2) патологический апоптоз – это процесс удаления поврежденных до нерепарируемого состояния структур организма.               
Апоптотический процесс имеет многофазную структуру. Обычно выделяют три стадии [6]: 1) сигнальная фаза (клеточная апоптотическая машина получает индуцирующий сигнал от того или иного триггера через адапторные белки); 2) эффекторная фаза (происходит активация каскада белков-эффекторов и регулирующих их белков-модуляторов апоптоза); 3) деградационная фаза (на этой стадии белки-эффекторы осуществляют деструкцию клеточного материала). Затем погибшие клетки очень быстро (в среднем 90 минут) распознаются и поглощаются фагоцитами [7].
Молекулы-эффекторы апоптоза. Основной сферой современных исследований апоптотического процесса является изучение механизмов регуляции ЗГК [8].  Это оправдано, т.к. система регуляции невероятно сложна и перегружена, а понимание ее даст контроль над всем процессом. Однако, мы считаем, что изучение  функционирования и взаимоотношения молекул эффекторного звена апоптоза также принесет необходимое понимание тонкого механизма изоляторного умерщвления клетки без воспалительной реакции.
Рассматривая процесс деградации молекулярной структуры клетки, можно выделить три обеспечивающих деструкцию синдрома [9]: протеазная гиперактивность, нуклеазная гиперактивность и липазная гиперактивность.
Протеазная гиперактивность. Деградация белковой составляющей клетки при апоптозе осуществляется особыми белками-эффекторами - цистеиновыми аспартат-специфичными протеиназами, сокращенно называемыми каспазами. Эти ферменты содержат в активном центре цистеин, субстрат же они расщепляют по остатку аспарагиновой кислоты (отсюда и название) [9]. На сегодняшний день известно 14 видов каспаз; нумерация их идет в соответствии с порядком открытия. Семейство каспаз делится на два подсемейства: CED-3 (являются непосредственной частью клеточной апоптотической машины) и ICE (являются участниками процессинга провоспалительных цитокинов; однако есть данные об их важности в некоторых случаях и для процесса апоптоза) [8]. К подсемейству CED-3 относятся каспазы –2, -3, -6, -7, -8, -9, -10; к подсемейству ICE – каспазы -1, -4, -5, -11, -12, -13, -14. Далее будут рассмотрены только  CED-3 – каспазы, как имеющие непосредственное отношение к ЗГК.
Практически в каждой клетке присутствует пул прокаспаз, которые легко процессируются в активную форму [10]. Это дает возможность достаточно быстро обеспечить протеазную гиперактивность в ходе апоптоза. Зимогенная форма (прокаспаза) состоит из четырех частей: 1) NH2-терминального продомена; 2) большой субъединицы (20 кДа); 3) малой субъединицы (10 кДа) и 4) линкерного участка (10 аминокислотных остатков) [8]. Активация прокаспазы происходит за счет делеции линкера и отрезания N-концевых доменов от освободившихся субъединиц. Затем происходит агрегация данных субъединиц в тетрамер с двумя активными центрами [11].
Каспазы работают по каскадному механизму: одна активирует другую или же идет аутопроцессинг. В каскадной иерархии принято выделять инициаторные каспазы и эффекторные каспазы, отличающиеся структурой терминального конца. К инициаторным относятся каспазы-2, -8, -9 и -10. Их функция состоит в активации (превращения зимогенной формы в активную) эффекторных каспаз (-3, -6 и -7), которые в свою очередь и осуществляют деструкцию белков клетки.
На сегодняшний день каспазы, как молекулярные эффекторы апоптоза, изучены больше, чем какие-либо другие компоненты исполнительного звена.
Нуклеазная гиперактивность. Клеточная апоптотическая машина представляет собой единую молекулярную систему, а деструктивный процесс развивается по каскадному типу, когда предыдущая подсистема активирует последующую. После начала протеолиза каспазами, последние (параллельно своему действию) включают нуклеазную подсистему апоптоза. Сейчас известно два пути активации каспазами клеточных нуклеаз. Первый способ состоит в расщеплении каспазами белка-фермента поли(АДФ-рибозо)-полимеразы, который участвует в процессе репарации ДНК, ингибируя активность Ca2+/Mg2+- зависимой эндонуклеазы [6]. Удаление в процессе протеолиза первого фермента активирует второй, вызывая тем самым нуклеазную гиперактивность. Второй путь связан с цитоплазматическим комплексом ДНКазы DFF40/CAD и ее ингибитора DFF45/ICAD. Каспаза-3 проводит расщепление белка-ингибитора, высвобождая активную ДНКазу, которая также фрагментирует ДНК. Следует заметить, что не только каспазы активируют эндонуклеазы. Этот момент обеспечивается также, например, и префицитом ионов Ca2+ в цитозоле.
Процесс деградации ДНК достаточно сложен и требует, также как и деструкция белков, каскадного функционирования нуклеаз. Так, было показано, что ДНК фрагментируется двумя способами [12, 13]: крупномасштабной фрагментацией на отрезки по 50 и 300 килобаз и межнуклеосомной фрагментацией на отрезки, кратные нуклеосомам. В первом случае расщепление идет по границам топологических доменов прикрепления к ядерному матриксу, а во втором – по межнуклеосомным линкерам. Понятно, что крупномасштабные фрагменты являются субстратом для нуклеаз, осуществляющих межнуклеосомное расщепление. Было также показано, что первый и второй типы (или этапы) фрагментации осуществляются скорее всего разными ферментами [12]. Есть данные, что за крупномасштабную фрагментацию отвечает топоизомераза II [13].
 Нуклеазный каскад, в отличии от каспазного, менее разработан и требует дальнейшего изучения.
Липазная гиперактивность. Липазная гиперактивность имеет в основном сигнальное значение. Основного внимания в этом отношении заслуживают среди клеточных липидов сфинголипиды и гликосфинголипиды [14]. При индукции, например, Fas-опосредованного апоптоза была замечена активация фермента кислой сфингомиелиназы (aSMase). Этот фермент производит гидролиз сфингомиелина до церамида и фосфорилхолина [15]. А церамид в свою очередь принимает участие в трансдукции проапоптотического сигнала [16]. Также есть сведения [9], что церамид может превращаться в ганглиозид GD3 (гликосфинголипид), являющийся потенциальным медиатором апоптоза.
Кроме того, внимания заслуживает фосфолипаза А2, участвующая в TNF--индуцированной ЗГК. Показано, что ее ингибирование гиперэкспрессией Hsp70 блокирует апоптоз [17].
Липазный механизм также требует дальнейшего изучения, которое имеет перспективу пролить свет и на разработку способов блокирования апоптоза в случаях, когда его наличие нежелательно.
Подводя итог, можно сказать, что несмотря на внушительное разнообразие молекулярных эффекторов апоптоза из-за большого объема и разнокачественности работ, которые нужно провести для деградации клеточного материала, их все можно без особых сложностей систематизировать по деструктивным синдромам, биохимическому действию и положению в каскадной иерархии. Открытие явления каскадного механизма функционирования клеточной апоптотической машины (последовательная активация эффекторов) можно назвать одним из самых перспективных в области ЗГК за последнее время, т. к. это позволяет находить ключевые молекулы, воздействия на которые дает возможность управлять всем процессом. Данное направление требует дальнейших исследований в фундаментальном (построение модели молекулярной каскадной системы апоптоза для разработок генных сетей in silico) и прикладном (поиск препаратов направленного воздействия на ключевые молекулы) аспектах.

СПИСОК  ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ:
1.    Зенков Н.К., Меньщикова Е.Б., Вольский Н.Н., Козлов В.А. Внутриклеточный окислительный стресс и апоптоз // Успехи современной биологии. – 1999. – Т. 119, №5. – С. 440 – 450.
2.    Зайнулин В.Г., Москалев А.А. Роль апоптоза в возрастных патологиях // Онтогенез. – 2001. – Т. 32, №4. – С. 245 – 251.
3.    Zhou BBS and Elledge SJ. The DNA damage response: putting checkpoints in perspective // Nature. – 2000. –  408: 433 – 439.
4.    Brison D.R. Apoptpsis in mammalian preimplantation embrios: regulation by survival factors // Pathol. Int. – 2001. – Dec; 51 (12): 948 – 53.
5.    Nunez G., Benedict M.A., Hu Y. and Inohara N. // Oncogene. – V. 17. – P. 3237 – 3245.
6.    Фильченков А.А., Бутенко З.А. Механизмы регуляции апоптоза и антиапоптическое действие онкогенных вирусов // Биополимеры и клетка. – 2000. – Т. 16, №6. – С. 455 – 467.
7.    Messam C.A., Pittman R.N. Asynchrony and commintment to die during apoptosis // Exp. Cell. Res. – 1998. – V. 238. – P. 389 – 398.
8.    Фильченков А.А. Каспазы: регуляторы апоптоза и других клеточных функций // Биохимия. – 2003. – Т. 68, Вып. 4. – С. 453 – 466.
9.    Рыжов С.В., Новиков В.В. Молекулярные механизмы апоптотических процессов // Российский биотерапевтический журнал. – 2002. – Т. 1, №3. – С. 27 – 33.
10.    Earnshaw W.C., Martins L.M., Kaufmann S.H. Mammalian caspases: structure, activation, substrates and functions during apoptosis // Annu. Rev. Biochem. – 1999. – V. 68. – P. 383 – 424.
11.    Green D.R. // Cell. – 1998. – V. 94. – P. 695 – 698.
12.    Разин С.В., Юдинкова Е.Ю. Крупномасштабная фрагментация ДНК при апоптозе: разрезается ли геном по границам топологических доменов? // Известия АН. Сер. Биологическая. -–1998. - №2. – С. 167 – 171.
13.    Хансон К.П. Апоптоз: современное состояние проблемы // Известия АН. Сер. Биологическая. -–1998. - №2. – С. 134 – 141.
14.    Hannun Y.A., Luberto C. Ceramide in the eukaryotic stress response // Trends Cell Biol. – 2000. – V. 10/ - P. 73 – 80.
15.    Levade T., Jaffrezou J.P. Signaling sphingomyelinases: which, where, how and why? // Biochim. Biophys. Acta. – 1999. – V. 1438. – P. 1 –17.
16.    Алесенко А.В., Соловьев А.С., Терентьев А.А., Хренов А.В. Роль продуктов сфингомиелинового цикла в развитии апоптоза, индуцированного через рецепторы Fas, и фактора некроза опухоли альфа // Известия АН. Сер. Биологическая. -–1998. - №2. – С. 157 – 166.
17.    Хлебодарова Т.М. Как клетки защищаются от стресса? // Генетика. – 2002. – Т. 38, №4. – С. 437 – 452.